真核细胞DNA的制备与定量

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备
1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS
5．2mg/ml蛋白酶K
6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿
7．无水乙醇、75%乙醇
二、操作步骤
（一）材料处理
1．新鲜或冰冻组织处理：
⑴ 取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
⑶ 加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培养细胞处理：
⑴ 将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
⑵ 离心4000g×5min，去除上清液。
⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取
1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
2. 离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。
3. 加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
4. 加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。
5. 加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。
6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。
7. 待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。
8. 沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min ，弃上清液。
9. 室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜。
(三）DNA定量和电泳检测
1.DNA定量：
DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。
DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。
2.电泳检测：
取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳，检测DNA的完整性，或多个样品的浓度是否相同。电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带。
三、注意事项
1. 所有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。
4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的。如要求更高，可进行DNA纯化。