蛋白芯片的基本原理及技术研究现状

随着分子生物学芯片技术研究工作的进一步深入开展，NDA芯片技术已经被逐渐应用于对生物样品中的各种已知或未知的核酸序列表达的检测和比较研究。但是，作为生物体细胞中实施化学反应功能成分的蛋白质，其相当部分与活性基因所表达的mRNA之间未能显示出直接的关系，因此使作为高通量基因表达分析平台的cDNA芯片技术的应用过程受到一定的限制。另外，由于蛋白质结构和构象方面的各种微小的化学变化均能引起活性或功能的改变，为了进一步揭示细胞内各种代谢过程与蛋白质之间的关系以及某些疾病发生的分子机理，必须对蛋白质的功能进行更深入的研究。随着DNA芯片技术的不断成熟以及基因研究所取得的令人瞩目的成果，进一步推动了蛋白质功能的研究及其相关技术的发展，蛋白芯片技术也就应运而生。本文拟对蛋白芯片的基本原理、相应技术研究的概况和存在问题进行综述。
1 蛋白芯片技术的基本原理
蛋白芯片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素体的蛋白质或其他成分与芯片作用，经漂将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。为了实现这个目的，首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的体上，同时能够维持蛋白质天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有特定的生物活性。另外，由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性，开发和建立具有多样品并行处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯处技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。
2 蛋白芯片技术的研究现状
在多年的蛋白芯片技术的研究过程中，研究者为了寻找合适的物质作为蛋白的载体进行了不懈的探索。例如日本学者Velev利用含有阳离子表面活性剂（HTAB）脂质体作为载体，通过戊二醛作用使其与一种铁蛋白包裹外壳的成分结合组装制备成为一种纳米水平的装配体，这种装配体可以在适当的pH条件下，使铁蛋白分子进入并固定于包裹外壳内面，形成蛋白质的载体。Adachi等利用某些固体表面或薄膜覆盖上含有电解质的薄膜作为载体，可以将胶体蛋白质颗粒成分转移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因组序列全长度阅读框架编码各种蛋白质的相互作用的过程，使用不同孔数的平板作为载体，建立了约含有6000个酵母转化株组成的平板蛋白芯片系统，平板上的每一个小孔中含有一个酵母转化株，可以根据其活性功能区开放阅读框架的编码表达生成一种蛋白质，利用这个系统可以用于蛋白质功能的检测和分析。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝胶板作为支持物，将蛋白样品置于凝胶上，然后经过电泳分离，使其成为蛋白的阵列用于进一步的研究。最近，哈佛大学蛋白芯片研究中心Gavin等利用制备DNA芯片的高精密度机械手的针状点样枪头在只有显微镜载玻片一半大小的玻片上，制备了第一张含有样品点数为10800的蛋白芯片。这张芯片用已纯化的蛋白，G按每点为1纳升的点样量点样10799次，另一次用FRB(FK-BR12-rapamycin binding domain of FKBP-rapamycin-associated protein)点样。为了确保不同分子量 的点样蛋白质都能够被固定在玻片上，他们首先在玻片表面涂上BSA,然后使用N,N’-二琥珀酰胺碳酸（N,N,-disuccinimidyl carbonate）激活BSA表面的赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基成为BSA-NHS玻片，其作用是促进BSA与点样蛋白质的结合而使蛋白质被固定于玻片上。在制备芯片过程中，为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性，他们在蛋白质点样的磷酸盐缓冲液中加入40%的甘油，以防止因体的蒸发而造成的蛋白质变性。点样后再经3h的温浴并将零片浸泡于含有小牛血清蛋白（BSA）的缓冲液中，使芯片表面含有一层小牛血清蛋白，用于封闭与其他蛋白质产生非特异性结合的部位及在表面未参加反应的醛基。为了检测芯片的应用，他们用不同荧光抗体分别标记能与蛋白G和FRB特异结合的IgG和FKBP12（12Kd FK506-binding protein）并作用于蛋白芯片，观察这些蛋白质与蛋白芯片的相互作用，其结果清晰地显示芯片上的蛋白G和单一的FRB点样分别被标上蓝色和红色荧光。该实验研究建立了蛋白质样品微量点样技术并使蛋白质固定于载体上时能够保留原有的构象和生物学活性，这将为今后对蛋白质多样品的并行研究或快速分析——为制备高通量功能检测的蛋白芯片奠定了技术基础。
3 蛋白芯片的应用研究
目前，学者们正在开展有关蛋白芯片技术应用的研究，Holt等利用蛋白芯片技术筛选能够相互结合的特异抗体抗原成分，他们利用12种表达较强但尚未接触任何抗原的抗体片段筛选含有27648种人胎脑蛋白的蛋白芯片，从中找出了4组高度特异性的抗原（蛋白）-抗体复合物，其中有3种抗体结合的蛋白质功能未明，但是由于表达水平都较低，说明这种抗原-抗体的结合技术是一种具有较高特异性和敏感性的筛选方法，可以用于高通量筛选分离各种不同的抗体成分，或检测基因的表达和蛋白分子间的相互作用，这将有助于对某些疾病（包括肿瘤）的发病分子机理的研究，以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子。根据蛋白芯片技术的基本原理，可以将不同的抗体固定于载体上成为抗体蛋白芯片，用于检测不同组织产生的蛋白质。
Ge在蛋白质的相互作用的研究中，采用了一种通用的蛋白质芯片系统，该系统敏感有效，用途广泛，可定量测定及重复使用，而且操作简易。
Gavin等应用蛋白芯片技术观察代谢过程有关作用物和酶的相互作用关系。他们选择三对没的激酶-作用物系统，即依赖3’，5’-磷酸蛋白激酶-Kemptide; 酷蛋白激酶Ⅱ-蛋白质磷酸酶抑制因子2和p42促有丝分裂剂激活蛋白（MAP）激酶（ErK2）-E1K1,首先将各系统的作用物按顺序固定于三张BSA-NHS玻片上，分别在有同位素γ-³³P ATP的环境中，与不同蛋白激酶温浴，然后，玻片经用乳剂处理后可在光镜下观察到各种蛋白激酶催化特异的作用物产生磷酸化反应。其结果提示蛋白芯片技术可以应用于作用物与酶相互作用的研究及代谢机制的分析。
Gavin等还在蛋白芯片技术研究过程通过DIG、生物素和合成的六氢吡喧酮胺（即AP1497）等三种具有对应的蛋白受体的小分子特质，研究蛋白的受体蛋白按顺序固定的相互作用。他们首先将三种小分子物质的受体蛋白按顺序固定于同一载体上并制备成为相同的四张蛋白芯片，将BSA分别用没的荧光物质（Alexa488、Cy3，或Cy5）标记，并分与DIC、生物素和AP1497三种小分子物质结合成为探针，用每一种具有不同荧光标记的探针作用地芯片，结果只能有能与小分子对应的受体蛋白被标上荧光。上述结果说明使用的荧光剂之间没有交叉的荧光激发和发光作用，因此，将三种标记探针混合后作用于蛋白芯片，则可使三种不同的受体蛋白同时标记上不同的荧光。研究结果提示蛋白芯片技术对于新药的发掘是十分有用的，因为它对寻找新药作用的靶点非常方便。
4 存在的问题及应用前景
虽然目前已经成功地制出了第一张具有高通量分析平参作用的蛋白芯片，通过适当的技术处理可以使点样蛋白保持天然的构象和生物学活性。但是，利用蛋白芯片技术对于蛋白质功能的研究仍然存在着种种问题，例如目前大多数来自于cD-NA文库的克隆体系不能通过正确的阅读框架编码蛋白质;或者不能正确表达产生具有氨基酸 全序列的蛋白分子；通过细菌表达的蛋白质不能形成正常的空间构象等，都将直接影响有关蛋白质功能的研究。另外，为了方便种类繁多的蛋白质的功能检测和分析，通过不同途径或方式获取并用于制作蛋白芯片的蛋白质必须首先经过纯化。正常和异常情况下蛋白质与蛋白质之间的相互作用的差别都需要我们进一步去探索。
综上所述，高通量分析平台蛋白芯片技术的建立将为蛋白质功能及其相关的研究提供快速、高信息量和更为直接的研究方法，与其他的分子生物学分析方法相比，蛋白芯片技术具有快速、平行的优越性。该方法的建立和应用将有助于人类揭示疾病发生的分子机制及寻找更为合理有效的治疗手段和途径。迄今为止，这一崭新的技术仍存在一些缺陷，有待进一步完善和发展。