(1) 目的基因组DNA片段的制备
基本原则：DNA片段之间存在部分重叠序列；DNA片段大小均一。
分离和纯化真核生物基因组DNA时，通常采用蛋白酶分解和有机相抽提的方法除掉蛋白质及脂类等其他大分子。基因组DNA片段化则主要采用物理剪切法和限制性内切酶法。
(2)外源DNA片段的全克隆
选择适宜的载体，与外源DNA片段相连。
常用的载体有质粒、噬菌体、粘粒（cosmid）以及YAC。这些载体可以克隆的DNA片段长度上限分别约为10、23、45和1000kb。选择载体的主要参数是基因组大小，即基因组DNA序列的长短。
例如，构建大肠杆菌（4.6′ 106kb）等基因组较小生物的基因组文库时，采用质粒作为载体便可得到满意的结果：按每个DNA片段平均长5kb计算，一个包括5000个DNA片段克隆的基因文库就能够代表一个完整的大肠杆菌基因组序列。构建较大基因组的文库时，噬菌体、粘粒以及YAC常被选作克隆载体。
通过转化或转导的方法将带有不同DNA片段的重组DNA分子导入受体细胞，获得一套包含特定生物体所有DNA序列的克隆。
(3)期望重组子的筛选
很多方法能帮助我们从基因文库的众多克隆中筛选和鉴定带有特定基因的克隆，它们大多是以杂交探测技术（hybridization probing）为基础的。
杂交探测是一种利用能和目的基因序列互补的DNA或RNA片段为探针，通过分子杂交的手段找出带有目的基因的DNA片段的实验方法。
用菌落（菌斑）原位杂交或免疫原位检测法可快速筛选基因文库。一般采用三步甚至两步筛选法，可以在短时间内完成全基因文库的筛选，其程序为：
首先制备高密度平板，使每块平板密集分布5000-10000个菌落或噬菌班，进行原位杂交；
由感光胶片上的斑点位置在原杂交阳性平板的相应区域挖下固体琼脂，用新鲜培养基洗涤稀释；
将稀释液再次涂布平板，使每块平板只含有200-500个可辨认的菌落或菌斑；
用相同的探针进行二轮杂交，直至准确挑出期望的重组克隆。
