限制性内切酶（restriction endonuclease）也称限制性酶（restriction enzyme），是由W. Arber，H. Smith和D. Nathans等人（1979年）从细菌中分离的一类酶。限制酶具有极高的专一性，识别双链DNA上特定的位点，将两条链都切断，形成粘末端或平末端。限制酶可以用来解剖纤细的DNA分子，在分析染色体结构、制作DNA的限制酶谱、测定较长的DNA序列、基因的分离、基因的体外重组等研究中是不可缺少的工具。对于研究DNA的分子生物学家来说，这是一把天赐神刀——分子生物刀。
限制性酶的生物学功能在于防御或“限制”入侵细胞的外DNA（如噬菌体DNA）。原核生物利用他们独特的限制性内切酶把外来DNA切成无感染性的片段。但不能降解自身细胞中的染色体DNA，因为细胞内还有“共座”的DNA甲基化酶修饰相应序列使之受到保护。
限制酶可被分成三种类型。I型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。I型限制性内切酶在随机位点切割DNA；Ⅲ型限制酶识别双链DNA的特异核苷酸序列，并在这个位点内或附近切开DNA双链。
Ⅱ型限制性内切酶已被广泛应用于DNA分子的克隆和序列分析，这是因为它们水解DNA不需要ATP，并且也不以甲基化或其他方式修饰DNA。最重要的是它们在它们所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA链。这些特殊序列常常含4个或6个核苷酸残基，通常具回文结构（palindromic structure），切割后形成粘末端（或平末端）。例如，大肠杆菌的一限制酶称EcoR I，它识别下列六核苷酸顺序：
5'……GAATTC……3'
3'……CTTAAC……5'
这种回文结构的两条链以5'→3'方向阅读序列都是一样的结构，当EcoR I遇到DNA的这种序列时，它会对这种DNA链进行交错切割，产生突出的5'末端。
5'……G AATTC……3'
3'……CTTAA C……5'
有些限制酶，如Pst I，它识别序列5'-CTGCAG-3'，并在A与G之间切割DNA双链产生3'突出粘性末端。还有些限制酶，如Bal I，DNA链产生具有平末端（blunt end）的DNA片段。
限制酶的命名较为特殊。以EcoR I为例加以说明。第一个大写字母E为大肠杆菌E. coil的属名的第一个字母，第二、三两个小写字母co为它的种名的头两个字母。第四个字母用大写R，表示所用大肠杆菌的菌株。最后一个罗马字表示从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。目前提纯的限制酶已很多，常用的约有100多种，并且已转化成为商品。大大节约了研究人员的时间。
