食品伙伴网服务号
 

Southern印迹杂交

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-07-01
Southern印迹杂交(Southern blot)是研究DNA图谱的基本技术,在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段,然后经碱变性,Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着,附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交,利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置,从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
(1)琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消解片段(0.3~25kb)分离开,分离大分子DNA片段(800-12000bp)用低浓度琼脂糖(0.7%),分离小分子片段(500~1000bp)用高浓度琼脂糖(1.0%),300-5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶。根据分离样品品质,分离速度和分辨率要求的不同,可选用不同规格的电泳槽。电泳时,同时将分子量标记物加到旁边孔中,便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜,电泳完毕,将胶浸到含0.5μg/ml EB的TBE缓冲液中染色30min,也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在灌胶前加入胶片中,在254nm短波透射灯下拍照,加橙黄色滤色镜,使用高速一次成像胶片,光圈f4.5,曝光20-40s。
(2)硝酸纤维素膜吸印。
[1]将胶片切成合适大小,切去右上角作为记号。
[2]将胶片放进盛有变性缓冲液(1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH)的盘中轻晃15min。
[3]换到中和缓冲液(1mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH)的盘中轻晃30min。
[4]裁一张硝酸纤维素膜、2-4张3mm滤纸和一些吸印纸(可用卫生纸),都与胶的大小相同(硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大,否则易形成旁路)。先将硝酸纤维素膜浸到水中,再放入10×SSC缓冲液,接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴手套操作。
[5]平盘上放一块比胶大的平板上面铺一张3mm滤纸,起灯蕊作用,盘中加入少量10×SSC缓冲液(2.5cm厚),不能没过平板,使3mm滤纸充分饱和。
[6]将胶倒扣在3mm滤纸上。
[7]浸湿的硝酸纤维素膜在胶上,对齐。铺膜时从一边逐渐放下,防止产生气泡,有气泡时,可用吸管赶出,不能让膜与胶下的滤纸直接接触。
[8]膜上放一张3mm滤纸,不能与胶接触。
[9]上面加吸印纸及重物(500g左右)。
[10]通过滤纸的灯芯作用,平盘中的缓冲液就会通过胶上移,从而将DNA吸印到膜上,及时更换浸湿的吸印纸,在室温下转印过夜。
[11]清除上面的东西。用镊子将膜取出,在6×SSC中洗一下。
[12]自然干燥,80℃烤2h。
[13]这是的膜就可进行杂交,或室温密封保存。
 
[ 网刊订阅 ]  [ 食品专题搜索 ]  [ ]  [ 告诉好友 ]  [ 打印本文 ]  [ 关闭窗口 ] [ 返回顶部 ]

 

 
推荐图文
推荐食品专题
点击排行
 
 
Processed in 0.154 second(s), 19 queries, Memory 0.88 M