类型I已知基因的序列
(1)已知DNA序列,包括三种情况,一是已知目的基因的DNA全部或部分DNA序列(与题目要求略有出入);二是已知其它物种的同类基因的DNA序列(功能可能已知,与题目要求略有出入);三是已知目的基因cDNA全部或部分序列(属于题目要求已达到的类型)。
(2)已知目的基因表达产物蛋白等序列。
在这两种情况下一般采用PCR技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。
类型II已有基因图位或标记,转座子等条件,分别可采用转座子标签法、T-DNA标签法及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。
类型III为止目的基因序列
(1)差异表达序列,即目的基因表达具有组织、器官等时空差异性。可以采用随机引物多态性扩增技术,定向引物扩增技术和DDRT-PCR、SSH-PCR、RAP-PCR、DNA-RDA、cDNA捕捉法等进行克隆。
(2)无差异表达的目的基因,可采用文库筛选法、功能蛋白分离法即直接测须发等进行,是难度较大较繁琐的策略。
从基因分离克隆的方法进行分类可分为三类:一种类型是功能克隆,即根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列,再根据此序列合成寡聚核苷酸探针。从cDNA文库或基因组文库中调取目的基因。第二种类型是表型克隆。是近年来发展十分迅速的一类方法,例如差异筛选法、差减杂交(SH)、mRNA差别显示技术(DDRT-PCR)、代表性差异分析(RAD)抑制型差减杂交(SSH)等。第三类是无基因序列及表达功能信息,但具有基因遗传图,转座子标签等条件,常用图位克隆和转座子标签法克隆。