扣除杂交(subtractive hybridization)

扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实可行的办法是构建富含目的基因序列的cDNA文库。应用扣除杂交筛选法便可达到此种目的。
扣除杂交法的本质是除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分离的敏感性。下面以T细胞受体(T-cellreceptor，TCR有时亦称之为T细胞抗原受体)编码基因的分离为例子，说明扣除杂交筛选法的基本原理与简要过程。T细胞和B细胞来自共同的前体细胞，两者都能够识别特异的抗原。但与B细胞不同，T细胞不能识别游离的抗原，而只能识别展现在其它细胞表面的抗原。T细胞的这种抗原识别特异性是由TCR基因决定的。
TCR基因只能在T细胞中表达，而不能在B细胞中表达。那么从T细胞mRNA制备来的单链cDNA，同大大超量的B细胞的mRNA在有利于发生DNA~RNA杂交的条件下保温，其结果便会出现这样的情况：所有的能够在T和B两类细胞中同时表达的T细胞基因的cDNA分子(约占98％)，都能与B细胞的mRNA退火形成DNA—RNA杂交分子，而不能在B细胞中表达的、T细胞特有的cDNA(约占2％)，由于B细胞中没有相应的mRNA，故不能形成DNA—RNA杂交分子，仍然处于单链的状态。将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱(hydroxylapatitecolumn)，于是DNA—RNA杂交分子便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。如此回收到的T细胞特异的cDNA被转变为双链eDNA之后，与适当的λ噬菌体载体重组井转染给大肠杆菌寄主细胞，这样便得到了T细胞特异eDNA高度富集的扣除文库。然后再按照同样方法制备扣除的eDNA探针，即被B细胞mRNA杂交扣除了的T细胞特异的cDNA探针，筛选文库，结果成功地分离到了T细的TCR基因。
扣除杂交法同样也可以用来分离缺失突变基因。从野生型植株制备的染色体总DNA，用一种适当的核酸内切限制酶[比如Sau3A]切割成小片段。同时从缺失突变体植株制备的染色体总DNA，经随机切割之后，用生物素(biotin)进行标记，供作非同位素标记探针使用。取大大超量的此种探针，同Sau3A酶切的野生型染色体总DNA片段混合，经变性、退火处理，溶液中的无生物素标记的野生型的DNA分子便同生物素标记的突变型的DNA探针杂交。将杂交反应混合物通过生物素结合蛋白质柱(avidincolumn)。这种柱是用包裹着生物素结合蛋白质的专用的细小磁珠装填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突变型植株的生物素标记的DNA探针杂交，便被结合到柱上。而野生型植株的DNA片段月，由于在突变型DNA中缺失了相应的片段，故没有相应的生物素标记的探针与之杂交，经洗脱便过柱流出。随后将洗脱收集的DNA同超量的生物素标记探针再杂交，再过柱。如此经过多次重复富集之后，用PCR法扩增DNA片段月，并予以克隆。最后用Southern杂交法进一步鉴定出，只同野生型DNA杂交而不能同突变型DNA杂交的含有突变基因的阳性克隆。