自主序列复制系统(self-sustainedsequence replication,3SR),又称依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)或再生长序列复制技术.1990年Guatelli等首先报道了这一技术.NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序.该反应有赖于AMV逆转录酶,T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同协作而完成.
3SR反应体系中除含有上述三种酶外,还含有dNTP,NTP(核糖核苷),两种特殊的引物和缓冲液.引物I3'末端与靶序列互补,5'端含T7RNA多聚酶的启动子,这一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的碱基序列与cDNA的5'未端互补.
在3SR反应时,首先引物Ⅰ与RNA模板复性(结合),AMV逆转录酶催化合成cDNA,RNaseH水解cDNA上的RNA,形成一条单链的DNA;引物Ⅱ随即与此cDNA的5'未端结合,逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA链.这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子.该酶即以此DNA为模板,转录出与样品RNA序列相同的RNA链,而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA.每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成cDNA.如此反复进行,将获得更多的RNA和cDNA.
其基本方法为:将引物,标本加入扩增反应液,65℃1min使RNA分子二级结构打开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNaseH,并在37℃反应1~1.5小时,其产物经琼脂糖电泳,溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带.NASBA的特点为操作简便,不需特殊仪器,不需温度循环.整个反应过程由三种酶控制,循环次数少,忠实性高,其扩增效率高于PCR,特异性好.