最近,人们把注意力集中到了活细胞的共振能量转移(RET,resonance energy transfer)技术上。利用这种方法可以非侵入性地监测特异蛋白质-蛋白质之间的相互作用。这些技术是建立在能量转移的基础上,在一个发光或荧光供体和一个荧光受体(如绿色荧光蛋白的突变体GFP)之间会发生能量转移。例如,在一些海洋生物(如水母Aequorea victoria和海参R. reniformis)中自然发生一种能量转移现象――生物发光共振能量转移。在这个过程中,Renilla的荧光素酶(Rluc)在有底物腔肠素的存在下能够发出蓝光(480nm),能够转移能量到GFP的突变体上[增强的黄色荧光蛋白(EYFP)], 随之后者发出530nm的绿光。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者的相互关系来进行评估。它们间的能量转移只有在Rluc和EYFP的两个融合蛋白接近到足够近(<100 A°)的距离时才能发生。BRET的信号可以通过比较EYFP发出的绿光和Rluc发出的蓝光的量来进行测量。因为BRET信号是一个比率数,不是一个绝对量,它消除了那些因为由于细胞数、细胞类型和其它实验变量而引起的数据变量。
图2. 生物发光共振能量转移(BRET)监测蛋白-蛋白互作。 |
这个方法已成功地应用于活细胞中受体二聚体形成(如胰岛素受体)和受体间相互作用等研究中。BRET也是一种灵敏地检测方法,可以应用于活细胞内转录激活核蛋白相互作用等研究中。
虽然BRET和FRET特别适合于高通量筛选,被使用于药物开发中,但是此技术目前因为关系到供体和受体间的距离障碍,所以还是有一些缺点。
向微型化分析的方向发展
小型化分析设备,如微矩阵和微流装置,已经得到充分的发展,同时不同的,基于传统的小规模分析的方法也得到进一步发展,如微孔板。