目前用于基因治疗的载体多为此种腺病毒载体。顾名思义，这种腺病毒载体不能在除包装细胞系（293、911、PERC6等）以外的细胞中复制增殖。其共同特点是：缺失了腺病毒基因组中某些复制增殖所必需的基因，这部分基因的功能由辅助细胞或病毒提供。
第一代腺病毒载体：
为E1和/或E3区缺失的腺病毒，容许携带6.5~8kb的外源基因，外源基因表达盒（包括外源启动子、目的基因以及终止子）一般被插入到E1区所对应的部分。前面提到，E3区编码蛋白与腺病毒逃避宿主免疫监视有关，与病毒复制增殖的关系不大，因此在构建腺病毒载体时常常被去除，以扩大腺病毒载体的装载容量。E1区是腺病毒基因组进入细胞核后立早表达的基因，对后续其他基因的表达以及病毒复制起到至关重要的作用。但是如果腺病毒载体中保留E1区，当其感染细胞后会有大量的病毒蛋白表达，不仅对细胞有毒，还会引起很强的宿主抗病毒免疫反应。为解决这一矛盾，人们在一些细胞系的基因组中整合了腺病毒基因组左端一段包括E1区基因的序列，构建了所谓腺病毒包装细胞系（如293、911以及PERC6等），这些细胞系可以反式提供E1区的功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。虽然体外实验表明这种方案是可行的，体内实验却发现第一代腺病毒载体仍会引起较强的免疫反应，使目的基因不能长效表达。造成这种现象的主要原因是：一方面许多细胞有E1样蛋白表达，即使是低水平的表达也会激活E2区基因的功能，导致病毒复制增殖和表达晚期蛋白，甚至会产生一些可复制的腺病毒（RCA, replication-competent adenovirus）；另一方面，研究发现当以较高的MOI（感染复数，病毒/细胞 Multiply Of Infection）感染细胞时，E2区对E1区功能上的依赖可以被忽略，病毒仍可以复制并表达晚期基因。另外，第一代非增殖型腺病毒载体最多只能装载约8kb的外源基因，这对于许多基因治疗方案来说仍是远远不够的。虽说存在着上述一些不足，第一代复制缺陷型腺病毒载体仍然是基因转移的一个非常好的工具，他的转基因能力适应于大多数的基因治疗方案，能够比较容易地获得高滴度的病毒。它不仅可以用于基因治疗，特别是肿瘤基因治疗，还可以用于表达重组蛋白质以获得基因疫苗，或是用于将目的基因转导入对其他转染方法不敏感的细胞株中。
第二代复制缺陷型腺病毒载体：
第二代复制缺陷型腺病毒载体在第一代的基础上，对E2区（甚至包括E4区）基因的部分或全部进行了缺失突变。由于对腺病毒基因组进行了更多的缺失突变，第二代腺病毒载体的转基因容量更大，允许插入最大约14kb的外源核苷酸序列。同时由于缺失了更多的腺病毒早期表达基因，如E1、E3、DNA聚合酶、IVa2以及pTP等，病毒蛋白的表达被进一步降低，由第二代腺病毒载体所引起的宿主抗病毒免疫反应与第一代比较要弱很多，因此在靶细胞中更稳定，目的基因的表达时相也更长。与第一代腺病毒载体一样，第二代腺病毒载体的获得有赖于辅助细胞（或）病毒提供其所缺失的反式作用元件。人们已经建立了多个细胞株用作第二代腺病毒载体的辅助细胞，如可表达E2a区的DNA结合蛋白、E2b区的DNA聚合酶、E2b编码的末端蛋白以及可表达全部或大部分E4区蛋白的细胞株。但是由于当腺病毒的一些反式作用元件共同出现在一个细胞株内时表现出较强的细胞毒性，而且编码这些蛋白的DNA大都是以染色体外游离的形式存在，导致这些细胞株的稳定性较差，成熟腺病毒颗粒的产量较低，病毒滴度下降。另外，尽管动物实验已经证实第二代腺病毒载体所引起的机体免疫反应明显弱于第一代，但仍有少量的腺病毒晚期蛋白表达，这说明若要完全去除腺病毒晚期蛋白表达需对腺病毒载体进行更加深入的改造。
第三代腺病毒载体：
即所谓空壳载体（gutless or gutted adenovirus vectors）或（hdAd, helper-dependent adenovirus vector）。有关这种腺病毒载体的设想来源于对一些无感染能力的腺病毒颗粒的观察。研究发现，尽管这些无感染能力腺病毒颗粒的基因组成千差万别，但是它们都共同含有腺病毒基因组最左端的一段序列，即包装信号（ψ）。因此人们设想：构建一种腺病毒载体，仅保留包括左右端ITR以及包装信号的约500bp的顺式作用元件，去除腺病毒基因组中全部的反式作用元件，而这部分功能由辅助病毒提供。这无疑是防止腺病毒晚期蛋白表达最简单、直接也是最有效的方法。它在保留了第一代新病毒载体基因转在效率高等一些优点的同时，外源基因的装载容量扩大到约37kb。由于去除了全部的腺病毒蛋白编码序列，安全性进一步提高，引起机体免疫反应的可能性降低，因此外源基因的表达时相明显延长，有报道称可达一年以上。另外，由于hdAd的主要特点之一是载体的血清型是由辅助病毒决定的，只需采用不同的辅助病毒，就很容易包装出不同血清型的空壳载体，实现血清型转换（serotype switching），因此hdAd可以反复经系统途径给药，而无需担心机体抗腺病毒中和抗体的影响。虽然hdAd有以上种种优点，但其目前还只限于临床前研究阶段，主要是因为有以下两个技术上的难题需要解决。首先是如何去除辅助病毒的污染。用作辅助病毒多为第一代腺病毒载体，很难用常规的方法将其与hdAd完全分开。已有几种方案用于这方面的研究，其中以拿大的Graham教授等人提出的用Cre/LoxP系统剪切辅助腺病毒包装信号的方法最为可行，应用也最为广泛。具体方法是在辅助腺病毒包装信号的两侧分别插入一段同向排列的LoxP序列（P1噬菌体Cre重组酶的特异性识别位点）。这种修饰对腺病毒在293细胞内复制增殖不会造成影响，然而这种经修饰的辅助腺病毒一旦感染293来源的可稳定表达Cre重组酶的293Cre细胞，Cre酶会对包装信号两侧的LoxP位点进行剪切，这种失去了包装信号的辅助病毒仍然可以反式提供hdAd所需的各种腺病毒蛋白，却不能包装成成熟的腺病毒颗粒。借助高效特异的Cre/LoxP重组系统，hdAd与辅助腺病毒在共转染293Cre细胞并传过几代之后，混杂的辅助腺病毒将降到0.1~0.01%左右。另一个需要解决的是hdAd DNA大小和填充物（stuffer）的问题。我们知道，腺病毒颗粒的有效包装下限是野 生型腺病毒基因组长度的75%，（即约28kb）。若低于此限，则需额外插入适当的DNA充当填充物使其达到28kb以上，否则不被包装或DNA分子发生重排。然而，DNA填充物的选择对hdAd的功能非常重要。比如，以一段22kb长的λ噬菌体DNA为填充物的hdAd，在体外实验时目的基因的表达量非常低，当经静脉途径注入小鼠体内时会引起明显的针对λ噬菌体DNA所产生的蛋白质的CTL （cytotoxic T-lymphocytes）杀伤。相反，若是插入一段相似的人次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）则不仅会明显地提高目的基因的表达，而且不会引起明显的CTL杀伤。因此可以说，去除腺病毒所有的编码序列本身并不能保证目的基因的长效表达，同时也说明填充物的选择必须非常慎重，一般应遵守以下原则：人源化、无重复序列、无已知基因并且有与腺病毒基因组相似的GC含量。
