在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).
(1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)
按上表制所需的胶液,将梳子插入模子,从梳子一端加入胶,当胶液快到梳齿时,使 模子向加胶端倾斜,继续慢慢加胶,边加边放端模子以防止气泡形成,室温放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子,顶部加入1×TBE封闭,备用.
(2)电泳
取10μlPCR产物,加入10μl变性剂(95%甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油,煮沸5min,取出立刻放入冰浴中2min以上,然后将水相全部上样,10-15℃下 电泳.开始在300V电压下电泳5min,然后在120V电泳8h,取下凝胶,将其浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色30--45min,在紫外灯下观察,或进行银染.
(3)银染法
将PAG板用去离子水洗二次,浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗 二次,再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次,然后浸入1.5%NaOH和 0.4%甲醛溶液中显色7min.最后,用0.75%NaCO3终止显色.