双链DNA探针切口平移法

    当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性,能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。
　　材料： 待标记的DNA。
　　设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。
　　试剂：
　　(1)10×切口平移缓冲液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml BSA。
　　(2)未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外,其余3种分别溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中,浓度为0.3mmol/L。
　　(3)[α-32 P] dCTP或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
　　(4) E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4单位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。
　　(5)DNA酶Ⅰ:1mg/ml。
　　(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
　　(7)10mol/L NH4Ac。
　　操作步骤:
　　(1) 按下列配比混合:
　　　　未标记的dNTP 10μl
　　　　10×切口平移缓冲液 5μl
　　　　待标记的DNA 1μg
　　　　[α-32 P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl
　　　　E.coli DNA聚合酶 4单位
　　　　DAN酶 I 1μl
　　　　加水至终体积 50μl
　　(2) 置于15℃水浴60分钟。
　　(3) 加入5μl EDTA终止反应。
　　(4) 反应液中加入醋酸铵,使终浓度为0.5mol/L, 加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。