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荧光标记DNA探针在细胞核混悬液杂交中的应用

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-07-06

  (1)细胞核的分离:将培养的细胞制成细胞混悬液,或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核(Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 )。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后,使核从细胞分离,细胞核混悬液浓度为4~5×106细胞核/ml。

  (2)细胞固定和酸的处理:在5ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10min。在4℃离心(×150g)10min。重复加三次冷的100%酒精入试管内,离心,倾去。置于冰上10min,再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100(IBM配方:50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0)。再离心,重复IBM漂洗(这时细胞核可在不染色情况下,以荧光显微镜观察)后,以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min,继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室温静置站立10min。倾去上清液,加IBm -Triton X-100漂洗,离心,使细胞核混悬液最终浓度为108/ml,(可用IBM-Triton X-100稀释约50倍,在血球计数器计数),混悬液镜检应含单个,完整的细胞核。

  (3)细胞核混悬液杂交

  ①配制杂交混合液:甲酰胺5份,20×SSC1份,50%硫酸葡聚糖2份,pH调至7.0。此原液(stock solution)可贮存在4℃冰箱内。应用时加1份10mg/ml鲱鱼精子DNA(herring sperm DNA)。
  ②混合1μl的细胞核混悬液(108/ml)与18μl的杂交混合液,充分混匀。将此19μl混合液移入1.5ml容积的Eppendorf 管中(核含量约为105)。
  ③加入100ng/每管的AAF标记DNA探针(如为生物素标记DNA探针浓度为20~40ng/每管)。
  ④置70℃10min使DNA探针和核DNA变性。
  ⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较,不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应,而应迅速转入37℃孵育过夜。

  (4)杂交后漂洗
  ①在每管中加入1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC(pH7.0),在42℃静置10~15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加100μl经dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞(107/ml)混匀,离心,室温,10min,轻弹试管使沉淀的小块散开,加入1.25ml 2×SSC(pH7.0),42℃,继之,静置于室温10~15min,如前离心,再加1.25ml IBM-Triton X-100,室温静置5min,离心。
  注:DEMS处理红细胞方法:经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中,细胞含量为108/ml,以K2CO3和DEMS溶液处理3次,第1次:K2CO3为20mmol/L,DEMS为3mmol/L,以后2次:K2CO3依然为20mmol/L,而DEMS为10mmol/L。在应用前将K2CO3和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中,应用100mmol/l K2CO3将pH调至9~10。在25℃,15min后,加入50μl,100mmol/l 的柠檬酸(citric acid)/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后,用2×SSC稀释到108/ml,加0.1%叠氮钠可在4℃保存至少1年。

  (5)AFF标记的荧光显示:加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清(NGS),轻轻振荡混匀,室温静置10min,加20μl 1:100的单克隆抗AFF抗体,37℃孵育45min,加1.25ml的PBS-Tween,室温静置10min,加20间歇性振荡,离心,倾去上清液,加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡,室温静置10min,加20μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清,稀释度1:100~1:300。孵育于37℃45min,加1.25ml PBS –Tween,室温静置10min,离心,倾去上清液。

  (6)生物素标记探针的荧光显示:加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10min后,加20μl抗生物素标记FITC抗血清15μg/ml,孵育在37℃30min,以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次,加入1.25ml IBm –Triton X-100,室温静置10~15min,间歇振荡、离心。

  (7)荧光显微镜观察:将细胞核混悬液稀释于250μl的IBM-Trion X-100中,轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上,选择适当的激发波长观察。

  (8)流式细胞计:将750μl的细胞核混悬液通过流式细胞仪(Flow cytometry, FCM),DEMS处理过的红细胞作为对照(Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT)。

 
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