1.组织处理
(1)冷冻切片:厚10~20μm,贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于-80℃,在应用于杂交实验前,使迅速回升到室温,干燥,固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中,pH7.4。PBS漂洗5min×3,孵育在2×SSc 10min。
(2)石蜡包埋切片:浸入二甲苯10min移除石蜡,以100%乙醇10min ×2,空气干燥10min,从高到低梯度乙醇(95%,80%,70%)1min/每个浓度。PBs 5min×3,孵育在2×SSc 10min。
(3)离心细胞涂片:将细胞先以4%多聚甲醛固定,应用离心沉淀法,将沉淀物涂于有粘附剂的载片上,应用PBS(含5mmol/l MgCl2)5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含(0.1mol/L甘氨酸)pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。
2.探针准备35pmol的寡核苷酸(oligo -)探针,3’ 终末标记以地高辛-11–dUTP。
3.预杂交和杂交加约300μl预杂交液(配制法见附录)在每张载片上,室温孵育1h。如为鲱鱼精子DNA,在应用前须在沸水浴中加热10min,而对酵母tRNA可不用加热变性。
(1)应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针,探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素(proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo –探针,其理想工作浓度为342ng/ml(0.342ng/μl)。
(2)预杂交后以2×SSC漂洗,以吸水纸拭干切片周围水份,加30μl杂交液在切片上,加硅化盖玻片,在37℃过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42℃。次日室温2×SSC液漂洗切片1h,1×SSC漂洗切片1h(室温),0.5×SSc 37℃洗半小时,0.5×SSC室温漂洗半小时。
4.地高辛显示。