FISH步骤

1、脱蜡：
1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；
2）100％酒精两次，每次2min；
3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脱水（-20℃预冷）。
3、变性：
1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min；
5）空气干燥。
4、杂交：
1）准备探针；
2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
3）滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；
4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
杂交后的水洗：
5）镊子小心去除盖玻片；
6）43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：
9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；
11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
扩增：
12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
13）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。
5、细胞核染色：
1）张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。