阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡,不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。
1.剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择,如pH高于蛋白质等电点,应选阴离子交换剂,反之应选阳离子交换剂。一般情况下,DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白,而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。
下面以DEAE-纤维素操作为例,介绍试验方法
2.膨胀活化 此步的目的在于除去杂质,暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml~8ml柱床体积。
称取所需的量,撒于0.5Mol/L NaOH溶液中(1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液),浸泡1h左右,不时搅拌。抽滤(以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤),以蒸馏水洗涤,再抽滤,直至滤液近中性为止,再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h,同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中,同样处理,洗至中性。
3.平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中(即起始缓冲液),静止1h,不时搅拌,待纤维素下沉后,倾去上清液或抽滤除去洗液,如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。
4.装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言,柱长和柱直径之比为10︰1~20︰1,柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h,然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。
装柱时,先剪一块圆形的尼龙纱布(直径与层析柱内径一致),放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管,夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上,倒入起始缓冲液至一半的柱高,除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE-纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡,如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹,使流速至1ml/5min,待缓冲液快接近纤维素面时,继续倒入纤维素糊,同时用玻璃棒搅拌表面层,以免使两次加入的纤维素形成分界层,通过进出缓冲液调节流量,也可通过塑料管的升降来控制,至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸(与柱内径大小一致),从柱的上端轻轻放入,使其沉接于纤维素床表面,以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的,无倾斜,整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡,使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。
5.上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液(4℃)平衡过夜,中间可换液数次。将柱的上端打开,用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出,不要吸净,留一薄层液面,以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品,注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹,使样品进入交换剂中,快要进完时,加1ml~2ml缓冲液冲洗柱壁,随即用多量的洗脱液洗脱。
样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系,超过这个比值,吸附就不完全,直接影响到分离的纯度。经过粗提的 —球蛋白50mg~100mg,用干重约4g DEAE-纤维素装柱分离,可获得理想结果。
6.洗脱 对于阴离子交换剂而言,洗脱的办法是使pH逐渐降低,而离子浓度逐渐升高。一般的办法,是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法,前者较实用,后者较准确。
7.洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集,并以20%磺基水杨酸测试,当蛋白液下来时,开始分管收集,至无蛋白液为止。
8.交换柱的再生 将使用过的DEAE-纤维素移入烧杯中,用2Mol/L NaCl液浸泡,抽滤并洗涤数次。如不立即使用,可加1/10 000的叠氮钠防腐,保存于4℃冰箱中。使用时,再以碱-酸-碱处理。