用siRNA沉默基因

RNAi在基础研究领域和医学研究领域的应用，其基础是siRNA的基因沉默作用。目前在体内或体外RNAi中应用的siRNA主要有两类：RNA和DNA载体。
1、 RNA
（1）siRNA：化学合成或体外转录的方法得到~21nt的两段小RNA，经退火后形成~19个碱基互补，两边3? 端各有2个碱基突出的siRNA。目前此类siRNA应用最广泛。尤其是经过修饰后提高稳定性的siRNA仍可表现特异的基因沉默作用，为其在体内的应用提供了可能的前景。
（2）esiRNA：因为上述的siRNA基因抑制的有效性关键在于靶基因序列片段的选择，但现在并不知道mRNA的哪一个部位对siRNA更敏感，所以根据靶基因mRNA设计的长dsRNA经Dicer剪切成一系列~21nt的siRNA－统称为esiRNA，可能更有效、更方便的抑制基因的表达。
（3）发夹RNA：根据miRNA设计的发夹RNA，或基于siRNA的发夹RNA在体内都表现出有效地基因抑制作用。
2、DNA载体
由于在哺乳动物和果蝇中不存在RNAi的扩增机制，导入以上RNA产生的RNAi作用不可避免的具有瞬时性。为了克服这个弱点，一些研究小组发展了基于DNA载体在体内表达siRNA的技术。这种载体可以是质粒，也可以是病毒，甚至可以是DNA片段。
（1）基于RNA聚合酶II启动子的表达系统：在弱或无干扰素应答反应的组织或细胞中，可以构建长的发夹RNA，进一步由Dicer剪切成siRNA。这种表达系统的优点是允许组织或细胞特异性的dsRNA表达，但是绝大部分哺乳动物细胞对长的发夹RNA的干扰素应答而产生非特异作用，限制了此类表达系统的广泛应用。
（2）基于RNA聚合酶III启动子的表达系统：目前主要应用的是U6启动子和H1启动子，一方面它们在体内有较高的转录效率，另一方面以数个连续T为终止信号，限制了RNA的大小从而不引起干扰素的非特异作用。此种表达系统还可分成三类：一是基于发夹RNA的基因沉默效应而设计的表达发夹RNA的质粒载体；二是在载体上构建两个启动子分别表达siRNA的正义RNA和反义RNA；三是共同导入分别表达siRNA的互补片段的含有U6或H1启动子的DNA片段，或者表达发夹RNA的DNA片段。尤其是后者，可以用PCR方法方便的获得，大大扩展了其应用。