确定了蛋白之间的相互作用后， 更重要的工作是研究其功能、结构及其作用的条件调节。鉴定在相互作用的一对蛋白中的任一蛋白突变对其相互作用的抑制作用， 不仅有助于探索相互作用的结构单位， 而且可作为研究体内功能的遗传学方法。这对于多个作用分子的蛋白就更为重要。 1996年Vidalix x等建立了反向酵母双杂交系统(reverse two-hybrid system)， 提供了简便的鉴定阻断蛋白间相互作用的方法。反向酵母双杂交系统的关键是掺入一种表达产物对细胞生长有毒的报导基因， 用于监测蛋白间的相互作用。例如酵母URA3基因表达产物是尿嘧啶合成所必需的， 同时它又可催化5-氟乳清酸(5-FOA)转化为有毒物质。Vidal等构建了一酵母细胞株， 其URA3的表达由含GAL4结合位点的启动子严密控制。此细胞株在缺乏尿嘧啶的培养基中培育需要GAL4激活结构域(GAD)和GAL4 DNA结合结构域(GBD)的融合蛋白的相互作用的表达。而在含5-FOA的完全培养基中则受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。因此可通过筛选5-FOA抗性克隆从随机突变库中鉴定阻断蛋白相互作用的突变体。
反向双杂交系统可更有效地蛋白间作用的关键位点或起决定作用的个别氨基酸， 进而分析蛋白结构和功能的关系。此外此系统还可筛选能阻止某些蛋白间相互作用的肽或小分子物质用作临床治疗制剂。
