最著名的抗生素莫过于1929年由Flemming发现的青霉素（Penicillins）了。当时Flemming正在培养一种能够引起疖和某些其他类型传染病的细菌金黄色葡萄球菌。为了用显微镜检查培养结果，他不得不把培养皿的盖子拿掉一会儿。一天当他开始工作时，他注意到培养液被一种从空气中落入的蓝绿色霉菌所污染，在霉菌生长周围的一定距离内，细菌群遭到破坏。进一步研究发现，长有霉菌的清液对许多病原菌都有抑制和杀死作用。这种霉菌后来被鉴定为青霉菌。由青霉菌所产生的一类抗生物质总称为青霉素。青霉素发酵液中含有5种以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F和V等），它们的差别仅在于侧链R基团的结构不同，其中青霉素G在医疗中用得最多，它的钠或钾盐为治疗革兰氏阳性菌的首选药物，对革兰氏阴性菌也有强大的抑制作用。青霉素的结构通式可表示为
青霉素G的主要来源是生物合成，即发酵。化学家通过利用化学或生化合成的方法，将青霉素G的R侧链转变成其他基团，而得到了效果更好的类似物，如目前临床上广泛使用的氨苄青霉素和羟氨苄青霉素（又名阿莫西林）。药物化学中将这种在已知药物（先导化合物）结构基础上设计新药物的方法称为结构改造。通过结构改造往往能够得到疗效更好的新药物，因此这一方法被广泛用于药物设计中。像氨苄青霉素和羟氨苄青霉素这样的抗生素是以天然抗生素为原料，经过“加工”（即化学或生化反应）而得到的，所以称为半合成抗生素。自1959年以来，各国报道的半合成青霉素已达上千种。
青霉素在临床上主要用于治疗葡萄球菌传染症如脑膜炎、化脓症、骨髓炎等，溶血性链球菌传染症如腹膜炎、产褥热，以及肺炎、淋病、梅毒等。已有的研究认为，青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。细菌的细胞壁是一层坚韧的厚膜，用以抵抗外界的压力，维持细胞的形状。细胞壁的里面是细胞膜，膜内裹着细胞质。细菌的细胞壁主要由多糖组成，也含有蛋白质和脂质。革兰氏阳性菌细胞壁的组成是肽聚糖占细胞壁干重的50％～80％（革兰氏阴性菌为1％～10％）、磷壁酸质、脂蛋白、多糖和蛋白质。其中肽聚糖是一种含有乙酰基葡萄糖胺和短肽单元的网状生物大分子，在它的生物合成中需要一种关键的酶即转肽酶。青霉素作用的部位就是这个转肽酶。现已证明青霉素内酞胺环上的高反应性肽键受到转肽酶活性部位上丝氨酸残基的羟基的亲核进攻形成了共价键，生成青霉噻唑酰基—酶复合物，从而不可逆的抑制了该酶的催化活性。通过抑制转肽酶，青霉素使细胞壁的合成受到抑制，细菌的抗渗透压能力降低，引起菌体变形，破裂而死亡。
青霉素的低毒性是由于它能够高度特异性地抑制转肽酶。还不知道人体内哪个酶能识别它这样的结构。正因为这样，青霉素并不干扰人体的酶系统。它选择性地作用于细菌并引起溶菌作用，但几乎不损害人和动物的细胞，所以青霉素是一类比较理想的抗生素。
青霉素的问世可谓20世纪医学发展中的一个里程碑，使过去曾是致命的疾病得到了有效治疗，拯救了数以千万计的生命。但是随着青霉素的大规模使用，越来越多的细菌对它产生了耐药性（例如，青霉素G开始使用时，只有8％的葡萄球菌对它有耐药性，到1962年，耐药的葡萄球菌增加到70％，其他抗生素也有类似的情况），使一些传染病又重新开始威胁人类生命。已有研究表明，一些细菌之所以对青霉素产生耐药性，是由于它们逐渐产生了一种能迅速分解青霉素的酶——β-内酰胺酶的缘故。已有足够的证据表明，β-内酰胺酶的基因早在使用青霉素之前已存在于细菌。目前，化学家针对该酶活性中心部位含有丝氨酸残基的特点，设计出与青霉素分子结构相似的β-内酰胺酶抑制剂青霉烷砜。青霉烷砜与β-内酰胺酶共价结合后形成失活态，使该酶变成“死”酶。其过程可表示为
因此，将青霉烷砜与青霉素合并用药，能增强抗菌活力。