乳酸链球菌素及应用

    据统计，全世界经约有10％～20％的食品损失源于各种腐败变质。在食品工业中防腐剂是最重要的添加剂之一，食品防腐剂一般分为合成防腐剂和天然防腐剂。目前我国大量使用的还是苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类等化学合成防腐剂。但经长期的研究发现，一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点。因此，近年来研究者把目光投向天然防腐剂的开发。经多年精心研究，已经发现了几十种细菌素，已被鉴定的细菌素有Nisin、Lactacin、Lactocin、Helveticin、FerITienticin、Sakecin、Lacticin、Plantacin、Subiicin等，其中已被广泛应用的是Nisin，也称尼生素。乳酸链球菌素又称乳球菌肽或乳链菌肽，英文名为Nisin，是N型血清的某些乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小肽。
　　早在1928年，美国Roger等人发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制保加利亚乳杆菌，在其后的20多年里，许多科学家对其结构、功能等进行了深入的研究。1989年联合国粮食及农业组织（FAO／WHO）、食品添加剂联合国专家委员会对Nisin给予食品防腐剂的国际承认后，迄今为止，已有英、美、法等50多个国家和地区批准Nisin作为食品防腐剂，乳酸链球菌素（Nisin）作为一种安全的食品防腐剂在发达国家被应用的历史已达40余年，世界上有不少国家，如英国、法国、澳大利亚等对在食品中Nisin的添加量不做任何限制。1992年3月，我国卫生部在批准实施的文件中也指出：“可以科学地认为，乳酸链球菌素作为食品保藏剂是安全的。
　　一、结构和特性⒈结构乳酸链球菌素（Nisin）的分子式为C143H228N42O37S7，由34个氨基酸残基组成。随着研究的深入，人们已经发现Nisin有6种类型，分别为A、B、C、D、E和Z，其中对NisinA和NisinZ的研究最活跃。
　　Nisin的一级结构是由34个氨基酸组成的多肽，N末端为异亮氨酸，C端为赖氨酸，含两种特殊氨基酸Dha和Dhb，有5个硫醚键形成的分子内环，其中一个称为羊毛硫氨酸，其他四个是β－甲基羊毛硫氨酸。相对分子质量为3510，活性分子常为
　　二聚体或四聚体。NisinZ和NisinA仅在27位氨基酸残基有差别，A为His，而Z为Asp。两者的抗菌特性几乎无差别。
　　2溶解度和稳定性
　　Nisin的溶解度随着pH值的下降而显著增加，当pH＝2．5时溶解度为12％，pH＝5．0时为4．0％，但当pH为中性和碱性时Nisin则不溶解。
　　Nisin的稳定性亦与溶液的pH值有关，当把Nisin溶于pH＝2的盐酸中，Nisin可经115．6℃高压灭菌而不失活；而在pH＝5时，灭菌后丧失40％的活性；当pH＝6．8时丧失90％以上活性。但把Nisin加入食品后，由于受到牛奶等大分子的保护，稳定性大大提高。Nisin的稳定性与温度亦有紧密关系，将添加250IU／gNisin的pH＝5．6～6．0、含水量54％～58％的巴氏灭菌精干酪贮藏于不同温度中，30个星期后，20℃中的Nisin残留量为90％左右，25℃中的
　　Nisin残留量为55％，30℃下降到小于40％。有关研究资料表明，Nisin的稳定性与防腐的底物、热处理条件等因素有关。
　　二、乳酸链球菌肽的防腐机理
　　Nisin能抑制大部分G＋菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属、梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显。另外，Nisin还可以和某些络合剂（如EDTA或柠檬酸）等一起作用，可是只有部分G－菌对之敏感。从分子水平上
　　探寻Nisin的抑菌机理一直是研究的热点，所持观点不一，但Nisin吸附在生物的细胞质膜上是杀菌的前提，这已为人们的共识，分歧在于Nisin如何进一步作用。
　　有的研究认为，Nisin可以抑制营养细胞的肽聚糖等物质的生物合成，是细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细胞内物质外泄，细胞裂解；有的研究认为Nisin单体中的DHA（脱氢丙氨酸）和DHB（β－甲基脱氢丙氨酸）可以与敏感型细胞膜中的某些酶的巯基发生作用；有的研究认为，Nisin能消耗敏感细胞的质子驱动力；还有的研究显示，Nisin属于“孔道形成蛋白”，导致K＋从胞浆中流出，ATP泄漏，胞外水分子进入，引起细胞自溶。也有人认为，Nisin对微生物的作用机理是Nisin对细胞膜的吸附，然后在细胞膜上形成孔洞。
　　Nisin是一个带正电荷的阳离子分子，在缺乏阴离子膜磷脂的情况下，Nisin起阴离子选择载体的作用；当存在阴离子膜磷脂时，Nisin吸附在膜上，利用离子间相互作用，其分子的C末端和N末端对膜结构产生作用形成穿膜“孔道”，从而引起胞内物质泄漏，导致细胞解体死亡。
　　最近研究表明，Nisin与EDTA联合使用对沙门氏菌和革兰氏阴性菌也有抑制作用。Nisin对营养细胞的作用点是细胞质膜，它能抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，使细胞壁质膜和磷脂化合物合成受阻，引起细胞内含物和ATP外泄，使细胞裂解。有人认为Nisin具有潜在的
　　跨膜序列及高的偶极矩，能使膜产生孔道，同时使膜内外电位差和梯度丧失，破坏细胞通过电子传递链产生能量的能力。
　　Nisin对芽孢的作用可能是杀死芽孢。据研究，Nisin的作用方式是杀菌。事实表明，当杀菌过程完成后，混合物中的Nisin仍保持一定的活力。在通常情况下，由于芽孢具有强烈的对热敏感性，这些残留的Nisin能抑制芽孢的发芽。
　　微生物对抗菌肽会产生适应性，最主要的原因可能是微生物的分泌蛋白酶。推测杆菌对Nisin的适应至少部分是由于其分泌一种可降解Nisin的蛋白酶。最近的研究表明，适应性产生原因可能是防止微生物吸收抗菌肽。此外，在与有膜活性抗菌肽的接触中，细胞可能改变其膜组成，因为不同膜磷脂组成会导致抗菌肽和细胞膜的亲和性不同，从而使微生物对药物的敏感性发生变化。研究发现对Nisin有抗性的单核细胞增生的李斯特菌菌株ScottA，相对于Nisin敏感株有不同的膜磷脂组成，Nisin抗性菌株膜中两性离子磷脂酰乙醇胺有显著增加，而阴离子二磷酸甘油的质量分数则降低。
　　对作用于细胞壁的抗菌物质，微生物同样也会产生一系列应激反应。