酶在食品工业中得到了广泛的应用,它是一种特异性的生物催化剂,在温和的温度和ｐＨ下发生反应。它们一旦从植物、动物和微生物中分离出来,就被认为在自然条件下是一种无毒的食品组分,同时被消费者认为是优于化学合成物质的食品加工助剂。应用酶制剂一般可以降低能耗,提高食品的质量和安全性,为农产品的应用开发提供了一条新的途径。
漆酶由于在纺织、造纸工业上的应用而被广泛研究,漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(ＥＣ1 10.3 2),能够氧化多酚类,含甲氧基的取代酚类、二胺和其它一些化合物,但是它不能象酪氨酸酶一样氧化酪氨酸。图1列出了典型的漆酶反应,苯酚经一个电子氧化形成一个自由基,进一步氧化形成醌类,当有自由基产生时醌类能够进一步聚合。漆酶可以从细菌、真菌和植物中得到,漆酶在葡萄酒、果汁和啤酒生产中存在着潜在的应用价值。
1 在葡萄酒中的应用
葡萄酒的稳定性是漆酶在食品工业中的一个主要应用。葡萄汁和葡萄酒是一种复杂的混合物,它含有不同的化合物,如乙醇、有机酸、盐类和酚类。乙醇和有机酸对葡萄酒芳香味有一定的作用,而葡萄酒的色泽和味道则特别依赖于在不同类型的葡萄酒中存在的酚类化合物。在葡萄酒中发现许多种酚类化合物。在所有的葡萄酒中都存在着不同数量苯乙烯酸衍生物和儿茶酚,而玫瑰红和红葡萄酒则以花色素为特征,葡萄中主要的色泽来源是锦葵色素,它是一种配糖物单体,在葡萄酒中酚类化合物的百分含量和组成依赖于生产过程中的许多变化因素。新鲜葡萄酒的感官特性从生产至消费都应该保持不变,换句话说,它至少在第一年的贮存期内应有足够的稳定性,在之后发生的一系列复杂的反应中,多酚类起着重要的作用,葡萄汁和葡萄酒在铁、铜和酶的催化作用下发生了氧化反应,这包括醛类、氨基酸和蛋白质引起的混浊、色泽变深及芳香味和风味的改变,这种氧化现象被命名为“马德拉群岛现象”。为了阻止在葡萄酒中发生的脱色作用和风味的改变,已经采用了不同的方法,如用聚乙烯吡咯烷酮(ＰＶＰＰ)去除酚类物质,用二氧化硫阻断氧化作用以及其它的一些方法。在葡萄汁中去除多酚类应该有选择性,要避免葡萄酒的感官特性发生不希望的变化,在“马德拉群岛现象”过程中可以用酶作为选择性的物理化学吸附剂,这些多酚类物质在酶催化下发生氧化、聚合,然后通过澄清的方法把它除去,为此目的而研究的一种酶就是漆酶。
这种处理手段具有专一性,并且它对葡萄酒的特性没有剧烈的作用,作为一种温和的技术而引起人们的兴趣。在葡萄酒中用漆酶来去除多酚类需要一些必要的条件,如适宜的ｐＨ(约2.5～4.0)、酸性缓冲介子和以亚硫酸盐作为可逆抑制剂以及其它的条件。有许多文献报导,在葡萄酒中使用漆酸酶能够提高它的稳定性。来自于多孔属杂色真菌的突变异种漆酶(最适ｐＨ2.7)在溶液中处理3ｈ能够去除70%的儿茶酚和90%的花色素。漆酶作用于黑色的葡萄汁能够去除50%的总多酚类,通过ＨＰＬＣ分析经酶处理和没有经酶处理的葡萄汁,可以看出这种漆酶作用的有效性。这种方法在作用的专一性和稳定性方面优于物理化学处理方法。在葡萄酒中使用漆酶使葡萄酒稳定性好、风味佳。结果显示在葡萄洒中使用来源于多孔真菌的漆酶作为澄清剂,接着添加硅藻土溶液或者热处理,最后通过超滤的方法去除氧化产物和酶蛋白是可行的。Ｚａｍｏｒａｎｉ在1989年用来自于加州的葡萄生产葡萄酒,在此过程中比较了丹宁酸酶、酚酶、漆酶或花色苷酶的作用,结果表明漆酶在去除多酚类时的效果优于其它的酶类,但作者提醒必须同时使用硫磺处理、澄清剂处理和过滤以去除氧化产物,用以上方法(漆酶加硅藻土溶液)处理的葡萄酒时加入二氧化硫和不加入二氧化硫的澄清方法比较,流程如图2所示,证明漆酶的使用是有效的,它优于或至少相当于传统的处理方法。感官分析证实葡萄酒使用漆酶和硅藻土溶液或者二氧化硫处理,在感官性质上有较强的抵抗“马德拉群岛现象”的作用。在葡萄酒发酵前处理中,与传统的澄清剂如蛋白质和聚乙烯吡咯烷酮相比,漆酶具有潜在的作用效果。在用漆酶和不用漆酶的情况下,评价雷司令葡萄酒的多酚含量、色泽、混浊稳定性和感官质量,结果显示使用漆酶处理制作的葡萄酒质量较好,表明在使用漆酶的情况下,添加很少或者不添加二氧化硫可以生产出稳定和高质量的葡萄酒。用(5～20)单位/ｍｌ的漆酶添加到葡萄汁中,然后过滤(用或者不用聚乙烯吡咯烷酮)或者澄清(用斑脱土或白明胶加硅藻土溶液或亚硫酸盐),结果表明使用酶处理为将来的研究提供了一个很好思路。
用漆酶处理葡萄酒的最初研究也证明这种酶在去除酚类化合物时有着巨大的潜在作用,可以从溶液中去除90%以上的阿魏酸和34%的酚酸。葡萄压榨→分离葡萄汁→酶处理(硅藻土加入)→倾析(加二氧化硫)→离心→过滤→酶钝化→煮沸图2 以漆酶处理生产葡萄酒工艺流程图到目前为止,漆酶还不允许作为食品添加剂使用(ＪＥＣＦＡ,ＦＡＯ/ＷＨＯ),这种酶以固定化酶的形式已经在葡萄酒的生产中应用,但必须保证它最终从葡萄汁中除去并再利用。来源于葡萄孢属灰质的漆酶以物理和化学的方法固定在有机和无机基质上,测试其对温和的溶液、葡萄汁和葡萄酒中酚类的去除效果。通过吸附和共价连接将漆酶固定在分子筛和硅胶和戊二醛上,结果它可以使溶液、葡萄汁和葡萄酒中儿茶酚浓度显著降低,并且酶可以再利用五次以上,将漆酶固定在琼脂糖活性基质上,并测试其在儿茶酚溶液和雷司令葡萄酒中的作用效果,固定化酶紧密排在不同尺寸的色谱中,用空气、Ｎ2和02平衡,溶液以不同流速通过反应器,收集洗脱样品并用聚乙烯吡咯烷酮处理,结果显示,流速越低脱酚作用越是显著,但色泽也加深。以固定化漆酶处理的葡萄酒较稳定,酶可再利用八次以上,只要贮存在适宜的条件下其活性在六个月后没有降低。当将漆酶以共价键固定在不同的多糖体上,其活性可以保留51%～63%,以它处理葡萄汁和葡萄酒,酚类的含量降低。以琼脂糖凝胶4ＢＥｐｉ-ＩＤＡ-Ｃｕ2+成功地将漆酶固定化,并能够去除酚类化合物,这些结果都证明了固定化漆酶在葡萄酒中的潜在应用。
近几年来,证明适度饮用红葡萄酒对人类健康有好处。研究人员已经证实红葡萄酒中多酚类物质具有抗氧化特性,然而对每种化合物的专一性作用人们知道的很少,因此分析漆酶和葡萄酒中重要化合物的相互作用是非常必须的。据报道,用漆酶处理红葡萄酒,证明漆酶主要对有抗氧化特性酚类化合物起作用,然而,用同样的漆酶处理白葡萄酒,总酚类含量显著降低,而不是主要作用于抗氧化多酚类,因此用漆酶处理白葡萄酒,总酚类含量显著降低,而不是主要作用于抗氧化多酚类,因此用漆酶处理白葡萄酒是可行的。另外,通过筛选得到了漆酶的同功酶,它可以使红葡萄酒中的酚类化合物含量降低,而且主要是使非氧化性多酚类含量下降。
2 在水果汁中的应用
自然产生的酚类物质和它们的氧化产物是天然饮料的重要成分,对饮料的色泽和风味有一定的贡献。酶类的应用,特别是那些能够降解多糖和蛋白质的酶类,在果汁的提取和稳定性方面发挥着重要的作用。对于苹果汁和葡萄汁,认为酚类的过度氧化对产品的感官质量是有害的。因此,测量天然饮料中的酚类含量对于充分地描述产品的感官品质和作为贮存稳定性的指示剂是非常必要的。通过漆酶来测定饮料中酚类含量,对于苹果汁,在酶分析和Ｆｏｌｉｎ-Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ分析总酚类含量间存在着一种线性关系,酶分析法对于预测天然饮料的稳定性是有帮助的。啤酒、葡萄酒和澄清果汁的混浊和沉淀是由一些不同的原因引起的,但是最常见的是蛋白质和多酚的相互作用,所说的稳定性好的饮料就是延缓蛋白质和多酚发生作用而引起的混浊。阻止水果汁的物理化学变质是关系到它的生产和流通系统以及消费者对产品内在品质认识的一个主要问题,众所周知,由酶和化学物质引起的褐变是饮料质量的主要问题,各种前处理和后处理都要尽量避免水果汁的后混浊和变色。为了使饮料稳定,广泛采用的传统处理方法是用白明胶、班脱土、硅胶和聚乙烯吡咯烷酮处理,各种酶处理方法已经被建议用于水果汁的稳定,漆酶就是其中之一。漆酶与超滤联用,不需要额外增加澄清剂能够生产出稳定澄清的苹果汁,Ｓｔｕｔｚ在1993年也证明使用漆酶和超滤,能生产出稳定、澄清的果汁而不会增加成本。使用漆酶与不同的方法相配,如巴氏杀菌、传统澄清剂(白明胶和硅酸盐)、过滤或超滤,证明使用漆酶与超滤与传统的维生素Ｃ和亚硫酸盐处理相比,提高了果汁色泽和风味的稳定性。
3 在啤酒中的应用
啤酒产品在包装时还是澄清的,但在长时间的贮存过程中都有形成混浊的倾向,这是酿造行业的一个永久的问题。啤酒的贮藏期依赖于许多因素,如温度、形成混浊的内在潜力和氧气含量等。在啤酒中,自然产生的少量的花色素前体多酚类常常使蛋白质产生沉淀,这是一般混浊形成的主要原因,这种现象常常表现为冷混浊,即在低温时产生混浊物在室温或更高温度时又溶解,这一般归因于氢键和脯氨酸的疏水相互作用。在后阶段酚环被蛋白质疏水基的亲核取代也会产生永久的混浊现象,即使温度升高混浊物也不会溶解。传统上,过量的多酚类是用不溶解的聚乙烯吡咯烷酮处理除去,由于聚乙烯吡咯烷酮具有很低的可生物降解性,要把它处理掉而不会对环境造成污染,这对于工人们来说是非常困难的。与传统方法相比,多酚氧化酶(如漆酶)的使用提供了一个新的选择,可以把漆酶添加到麦芽汁中。根据Ｍａｔｈｉａｓｅｎ1995年的报导,因为在最终的啤酒产品中,氧气是不希望有的,因此在生产的最后阶段加入漆酶,也许可以除去过多的氧气从而增加产品的贮藏期,同时漆酶也可以除去仍然存在于啤酒中的多酚类,加入漆酶后与多酚形成的复合物可以采用过滤或其它的分离方法除去,除了漆酶外,也可以在发酵的啤酒中加入一定的聚乙烯吡咯烷酮,Ｒｏｓｓｉ等在1988年也证实了在啤酒的稳定性方面漆酶的潜在应用。