乳酸链球菌素及应用

   据统计，全世界经约有10％～20％的食品损失源于各种腐败变质。在食品工业中防腐剂是最重要的添加剂之一，食品防腐剂一般分为合成防腐剂和天然防腐剂。目前我国大量使用的还是苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类等化学合成防腐剂。但经长期的研究发现，一些合成防腐剂有诱癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题。天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点。因此，近年来研究者把目光投向天然防腐剂的开发。经多年精心研究，已经发现了几十种细菌素，已被鉴定的细菌素有Nisin、Lactacin、Lactocin、Helveticin、FerITienticin、Sakecin、Lacticin、Plantacin、Subiicin等，其中已被广泛应用的是Nisin，也称尼生素。乳酸链球菌素又称乳球菌肽或乳链菌肽，英文名为Nisin，是N型血清的某些乳酸链球菌在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小肽。
早在1928年，美国Roger等人发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制保加利亚乳杆菌，在其后的20多年里，许多科学家对其结构、功能等进行了深入的研究。1989年联合国粮食及农业组织（FAO／WHO）、食品添加剂联合国专家委员会对Nisin给予食品防腐剂的国际承认后，迄今为止，已有英、美、法等50多个国家和地区批准Nisin作为食品防腐剂，乳酸链球菌素（Nisin）作为一种安全的食品防腐剂在发达国家被应用的历史已达40余年，世界上有不少国家，如英国、法国、澳大利亚等对在食品中Nisin的添加量不做任何限制。1992年3月，我国卫生部在批准实施的文件中也指出：“可以科学地认为，乳酸链球菌素作为食品保藏剂是安全的。
　一、结构和特性⒈结构乳酸链球菌素（Nisin）的分子式为C143H228N42O37S7，由34个氨基酸残基组成。随着研究的深入，人们已经发现Nisin有6种类型，分别为A、B、C、D、E和Z，其中对NisinA和NisinZ的研究最活跃。Nisin的一级结构是由34个氨基酸组成的多肽，N末端为异亮氨酸，C端为赖氨酸，含两种特殊氨基酸Dha和Dhb，有5个硫醚键形成的分子内环，其中一个称为羊毛硫氨酸，其他四个是β－甲基羊毛硫氨酸。相对分子质量为3510，活性分子常为二聚体或四聚体。NisinZ和NisinA仅在27位氨基酸残基有差别，A为His，而Z为Asp。两者的抗菌特性几乎无差别。
2溶解度和稳定性.Nisin的溶解度随着pH值的下降而显著增加，当pH＝2．5时溶解度为12％，pH＝5．0时为4．0％，但当pH为中性和碱性时Nisin则不溶解。Nisin的稳定性亦与溶液的pH值有关，当把Nisin溶于pH＝2的盐酸中，Nisin可经115．6℃高压灭菌而不失活；而在pH＝5时，灭菌后丧失40％的活性；当pH＝6．8时丧失90％以上活性。但把Nisin加入食品后，由于受到牛奶等大分子的保护，稳定性大大提高。Nisin的稳定性与温度亦有紧密关系，将添加250IU／gNisin的pH＝5．6～6．0、含水量54％～58％的巴氏灭菌精干酪贮藏于不同温度中，30个星期后，20℃中的Nisin残留量为90％左右，25℃中的Nisin残留量为55％，30℃下降到小于40％。有关研究资料表明，Nisin的稳定性与防腐的底物、热处理条件等因素有关。　　 二、乳酸链球菌肽的防腐机理
Nisin能抑制大部分G＋菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属、梭状芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌作用明显。另外，Nisin还可以和某些络合剂（如EDTA或柠檬酸）等一起作用，可是只有部分G－菌对之敏感。从分子水平上探寻Nisin的抑菌机理一直是研究的热点，所持观点不一，但Nisin吸附在生物的细胞质膜上是杀菌的前提，这已为人们的共识，分歧在于Nisin如何进一步作用。有的研究认为，Nisin可以抑制营养细胞的肽聚糖等物质的生物合成，是细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细胞内物质外泄，细胞裂解；有的研究认为Nisin单体中的DHA（脱氢丙氨酸）和DHB（β－甲基脱氢丙氨酸）可以与敏感型细胞膜中的某些酶的巯基发生作用；有的研究认为，Nisin能消耗敏感细胞的质子驱动力；还有的研究显示，Nisin属于“孔道形成蛋白”，导致K＋从胞浆中流出，ATP泄漏，胞外水分子进入，引起细胞自溶。也有人认为，Nisin对微生物的作用机理是Nisin对细胞膜的吸附，然后在细胞膜上形成孔洞。Nisin是一个带正电荷的阳离子分子，在缺乏阴离子膜磷脂的情况下，Nisin起阴离子选择载体的作用；当存在阴离子膜磷脂时，Nisin吸附在膜上，利用离子间相互作用，其分子的C末端和N末端对膜结构产生作用形成穿膜“孔道”，从而引起胞内物质泄漏，导致细胞解体死亡。最近研究表明，Nisin与EDTA联合使用对沙门氏菌和革兰氏阴性菌也有抑制作用。Nisin对营养细胞的作用点是细胞质膜，它能抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，使细胞壁质膜和磷脂化合物合成受阻，引起细胞内含物和ATP外泄，使细胞裂解。有人认为Nisin具有潜在的跨膜序列及高的偶极矩，能使膜产生孔道，同时使膜内外电位差和梯度丧失，破坏细胞通过电子传递链产生能量的能力。Nisin对芽孢的作用可能是杀死芽孢。据研究，Nisin的作用方式是杀菌。事实表明，当杀菌过程完成后，混合物中的Nisin仍保持一定的活力。在通常情况下，由于芽孢具有强烈的对热敏感性，这些残留的Nisin能抑制芽孢的发芽。微生物对抗菌肽会产生适应性，最主要的原因可能是微生物的分泌蛋白酶。推测杆菌对Nisin的适应至少部分是由于其分泌一种可降解Nisin的蛋白酶。最近的研究表明，适应性产生原因可能是防止微生物吸收抗菌肽。此外，在与有膜活性抗菌肽的接触中，细胞可能改变其膜组成，因为不同膜磷脂组成会导致抗菌肽和细胞膜的亲和性不同，从而使微生物对药物的敏感性发生变化。研究发现对Nisin有抗性的单核细胞增生的李斯特菌菌株ScottA，相对于Nisin敏感株有不同的膜磷脂组成，Nisin抗性菌株膜中两性离子磷脂酰乙醇胺有显著增加，而阴离子二磷酸甘油的质量分数则降低。对作用于细胞壁的抗菌物质，微生物同样也会产生一系列应激反应。
三、乳酸链球菌素在食品中的应用
Nisin它是一种多肽，进入人体后可降解为氨基酸，因此具有无毒、安全的特性。Nisin被加入到食品中，能有效地抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌，如乳杆菌、明串珠菌、小球菌、葡萄球菌、李斯特菌等，特别是对产芽孢的细菌，如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌有很强的抑制作用。在包装食品的生产过程中添加Nisin，可以降低灭菌温度，缩短灭菌时间，从而减少营养成分的损失，改进食品的品质，同时有效地延长了食品的保藏时间，还可以取代或部分取代化学防腐剂、发色剂（如亚硝酸盐），以满足生产健康食品、绿色食品的需要。Nisin作为一种新型的天然防腐剂，在国际上已得到认可，已广泛应用于鲜乳和乳制品、液体蛋、沙拉酱、高水分或低脂的食品、罐头食品、鱼贝类海产制品、肉制品、植物蛋白食品、糕点食品和含酒精的饮料等。
1．乳制品.Nisin已成功应用于硬质干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐装浓缩牛奶、高温灭菌牛奶、高温处理风味奶、酸奶、乳制甜点等制品中。在鲜乳中添加50ppmNisin，即可抑制造成鲜乳和乳制品腐败的耐热性细菌，使产品保存期延长2～3倍。研究显示，添加Nisin能使低脂的牛乳、无盐的奶油、无脂肪的牛乳、调味乳保存期延长至6周；添加80～100ppmNisin于罐装无糖炼乳中，可抑制耐热性孢子的生长，减少热加工时间10分钟。在干酪的加工过程中Nisin是最有效的保护剂。干酪原料经80～100℃巴氏消毒后，梭菌芽孢仍能存活，乳酪中的微生物为丁酸梭菌、酪丁酸梭菌、生孢梭菌，尤其是肉毒梭菌在加工的乳酪中产生毒素。研究表明经巴氏处理的干酪中加入500～1000IU／mlNisin能阻止梭菌的生长和毒素的形成，同时还能降低食盐和磷酸盐的用量。
2．肉制品.使用Nisin的肉制品有罐装火腿、熏猪肉、咸猪肉、香肠、真空包装新鲜牛肉等。造成肉制品腐败的耐热性细菌如杆菌属、乳酸菌属和链球菌属等，对Nisin相当敏感，因此添加Nisin可使经热加工的肉制品延长保存期2～3倍。使用的方法是将Nisin配制成150～200ppm的溶液再倒入肉制品中一起加工或喷涂在制品的表面再进行包装。但也发现，经Nisin处理的样品存在液汁流失过多和口味偏酸等缺点。Nisin在一定程度上能延长红肠的保质期，但单独使用效果不是很理想，最好能与其他方法结合使用。有人认为从生产成本和防腐效果考虑，Nisin（400mg／kg）和NaCl（3．5％，质量分数）对盐水鸭腿做浸泡处理，并经真空包装后的微波（915MHz，400W微波间歇照射两次）处理，能使盐水鸭腿的货架期达20天以上。
3．在酸性罐头食品中的应用在酸性条件下，Nisin的稳定性、溶解度、活性均提高，因而它可成功地应用于高酸性食品（pH＜4．5）防腐。低酸或非酸性罐头食品添加了Nisin，也能起到减轻热处理强度的作用。许多研究显示，添加Nisin于蔬菜罐头中，能有效抑制耐热性细菌的腐败，且能降低热加工时间，在米制清酒罐头中，添加Nisin可使热加工时间减少90％，且品质没有改变。碗豆罐头在55℃下存放7天就有败坏现象发生，添加Nisin于相同条件下，保存期可长达两年。Nisin作为一种天然食品防腐剂应用于瓶装酱菜，能够降低酱菜中食盐用量，效果优于化学防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾。它能有效地抑制乳酸菌再发酵和葡萄球菌、芽孢菌的生长繁殖。Nisin其自身安全性可靠Nisin的LD50值与食盐相当，是新一代的食用防腐剂。由于某些国家在食品中不准使用苯甲酸钠，所以Nisin的瓶装酱菜其卫生质量符合国家标准，并对产品风味无影响。
4．鱼贝类等海产制品中的应用海鲜制品因腐败速度快，且大多冷食，故产品的细菌数控制相当重要，如李斯特菌也曾于海鲜中检出，对人体造成危害。添加100～150ppmNisin可抑制革兰氏阳性菌，延长保存期和新鲜度，使用方法与肉制品相同。
5．沙拉酱和调味用酱汁添加Nisin于沙拉酱中，可有效抑制乳酸菌和孢子的生长，使低脂低盐产品的腐败性降低，可延长保存期达4倍之多，建议使用量为50～200ppm。
6．高水分或低脂的食品此类产品虽经热处理，因水分含量高，常有耐热性细菌或孢子残留造成产品腐败，如FHMHPP产品中，常有耐热孢子Bacilluscereus产生的毒素。使用Nisin能抑制此孢子的生长和繁殖，使保存期延长两倍或更高，在FHMHPP的产品中，Nisin的添加量为150～250ppm。
7．罐头汤类由于有些汤类会有极易破坏的香料，充分的热处理会变得复杂，乳链菌肽的用量100～200mg／kg即可有效地抑制嗜温细菌的芽胞。
8．经低温热处理的密闭包装产品.在食品加工过程中，存在高强度的杀菌影响产品品质，低温热处理而不能杀灭耐热孢子而达不到产品保质期的矛盾，如蛋白质、水果汁、布丁、茶、饮料等。Nisin能有效地抑制引起食品腐败的革兰氏阳性菌，从而很好地解决了食品加工中的矛盾，一般使用量在100～200ppmNisin就足以解决这一食品加工难题。　
四、发展前景　　Nisin是一种天然、高效、安全的天然食品添加剂符合未来食品防腐剂的要求，它能有效地抑制引起食品腐败的革兰氏阳性菌，特别对耐热芽孢杆菌、肉毒梭菌及李斯特氏菌有强烈的抑制作用，可降低食品灭菌温度、缩短灭菌时间、改善食品风味、外观和提高食品营养价值、延长保藏时间，符合国家农业行业标准NY／T392－2000绿色食品食品添加剂使用准则。在我国天然防腐剂的研究、开发虽比较晚，但随着食品工业的发展和人民生活水平的提高，天然防腐即将会在21世纪的中国大展宏图，必将对人类健康发挥巨大的作用。