DNA的合成、纯化及鉴定

　　由于现代科学技术的发展，DNA合成已广泛采用DNA自动合成仪，仅有少数特殊情况下采用人工合成。目前，主要有ABI(Applied Biosystem Inc.) 。Pharmacia、Backman等几家公司生产DNA/RNA合成仪，其中以ABI公司的仪器占我国及世界市场的80～90%。由于合成技术的现代化，人们已从繁重的劳动中得到解脱。输入合成仪的DNA序列，可以在数小时之内得到完成。我们所要做的工作只是合成柱取下，进行DNA切落和去保护基以及纯化，并进行量鉴定和计算合成率。

1. DNA合成仪的操作（略）

2. DNA原切落及去保护
　　取下DNA合成柱，置适量浓氨水(氢化铵，28%)中浸泡，一般为1ml氢氧化铵密封后55℃保温：～15小时，或70℃保温2小时，使合成的寡核苷酸片段从载体上切落并去除β-腈乙基磷酸保护基。

3.寡核苷酸片段的纯化
1）.NAP柱纯化：由Pharmacia公司生产，主要成分为Sephadex G-25，经特殊处理后装成的不同体积的小柱常用的有NAP-10。含寡核苷酸片段的氨水溶液，调整体积为1ml加样于NAP-10柱上(使用前，以15ml双蒸水平衡柱子)以1ml双蒸水洗脱，收集洗脱下的液体，即为纯化的寡核苷酸，NAP-10柱可以纯化长度在10mer以上的寡核苷酸，产率在90%以上。经NAP-10柱纯化后样品中盐的含量少于3%，完全可以满足实验的需要。

2）.丙烯酰胺凝胶电泳纯化，从合成柱上洗脱的寡核苷酸片段，冰冻、干燥、去氨水，溶于适量水中后，占样于15～20%丙烯酰胺凝胶制备胶上，按10V/cm条件电泳，过夜。电泳完毕后，取下凝胶于EB染色后观察，或直接将含寡核苷酸片段的凝胶置于硅胶荧光板上(CMC板)紫外线灯下，根据分子量的标准切下所需的区段
(呈黑色)，将胶块置少量缓冲液(10mmol/L Tris? HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA 300mmol/LNaCl)，捣碎胶块，25～42℃浸泡过夜(4～24小时)，或将胶块置于有少量缓冲液的透析袋中，通电下，寡核苷酸片段即进入透折袋中。洗脱的寡苷酸核片段以酒精沉淀、洗涤，真空抽干后即可应用。

浸泡法简单，成本低，易操作。电泳法较快，回收产率高，但需鉴定。此外还有HPLC(高效液相层析)，及寡核苷酸纯合柱(OPC，ABI生产)等方法可以纯化寡核苷酸片段。可以根据手头的材料，仪器及使用习惯而加以选择。

4.寡核苷酸片段的鉴定
　　可以采用PAGE、HPLC、FPLC等方法对合成的寡核苷酸进行鉴定。对于10～100mer的寡核苷酸，可以用20%浓度的丙烯酰胺凝胶电脉，观察电泳区带即可判断合成片段的纯度及片段大小。如果结合5′或3′末端核素标记放射自显影技术则结果更加可靠。采用FPLC和HPLC鉴定合成片段的纯度，速度快，精确度高，但需昂贵的仪器设备。合成片段最精确的鉴定方法是采用Maxam-Gilbert化学法测定核苷酸序列。

5.合成产物中DNA含量的测定
　　4种碱基的平均最大吸收波长为260nm。一般选用该波长测定DNA含量。测定前，稀释样品，使光吸收在0.2～1.2OD范围内。在石英比色杯中测定样品溶液光密度。

表14-1 合成寡核苷酸片段粗产量

产量=OD₂₆₀×25=OD₂₆₀实测值×稀释倍数×体积×25(m g/ml)一般认为对单链寡核苷酸片段，1OD₂₆₀=25m g/ml。
不同规格合成柱产量均不一样。