反转录病毒载体是常用的病毒载体之一。反转录病毒的DNA基因组的两端各有一个长末端重复序列(5'—LTR和3'—LTR)，有一个包装病毒颗粒时必需的非编码序列ψ+，同时有三个编码蛋白质的基因gag、pol和env。反转录病毒载体可以容纳外源DNA的长度在10 kb左右，以很高的转染率感染宿主细胞，特别是分裂中的细胞。转入宿主的细胞后，反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内，这种整合的位点是随机的。反转录病毒载体在构建时，删去了poi、env基因和gag基因的3’端，但保留了病毒颗粒所需的ψ+序列。其目的是在于提高载体的安全性，防止反转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害。这样，在制备反转录病毒载体时，就必须有一个辅助细胞系，这种细胞内有缺陷型病毒可以提供包装用的外壳蛋白，但自身没有包装信号。这样，反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。反转录病载体多半用于基因治疗，由于病毒载体在宿主细胞基因组上随机插入，人们担心会引起不安全的后果，这种载体还在不断改进之中。