当单色光通过厚度相同，而浓度很小的溶液时，根据朗伯—比尔定律，光被溶液吸收的程度，称为吸收度，与溶液的浓度成正比，与溶液的厚度成正比，即A=εCL，式中：A为吸收度，C为溶液的浓度，L为溶液的厚度，ε为消光系数。

由朗伯—比尔定律得，当一束单色光通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度（或厚度）不变，则溶液的厚度（浓度）愈大，光线强度的减弱也愈明显。

    用同样的方法配制的标准溶液和待测溶液，其浓度分别为C1和C2，对同类溶液ε相同，当厚度也相同时则：
A1=εC1L
A2=εC2L
C2=（A2/A1）*C1
    式中A1,A2可由罗维朋比色计直接读出，C1为标准溶液的已知浓度，据此可算出待测溶液的浓度。

朗伯—比尔定律

许多化学物质的溶液具有颜色（无色的化合物也可以加显色剂经反应生成有色物质），当有色溶液的溶度改变时，颜色的深浅也随之改变，浓度愈大，颜色愈深。因此，可以用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。这种方法叫做比色分析法。

一、 朗伯—比尔定律

当一束单色光通过有色溶液时，入射光线的一部分被器皿反射回来，一部分被溶液吸收，另一部分则透过溶液，如图所示。它们之间有以下关系：

Io=Ia+Ir+It      1-1
式中：Io—入射光强度，Ia—吸收光强度，Ir—反射光强度，It—透过光强度

由于在实际测定时，所用的比色皿都是同质料用规格的。反射光的强度为一定值，不会引起测量误差，所以反射光的影响可以不加考虑。则上式可简化为：
Io=Ia+It        1-2
从式1-2可知：当入射光强度Io为一定时，被吸收光强度Ia愈大，则透过光强度It愈小。也就是说：光强度的减弱仅与有色溶液对光线的吸收有关。

那么，溶液对光线的吸收与哪些因素有关呢？实验证明：溶液的浓度C愈大，液层厚度L愈厚（即光线在溶液中所经过的路程愈长），则溶液对光线吸收的愈多。它们之间的关系有下式决定：
lg = KCL      1-3
这个公式就是朗伯—比尔（Lambert---Beer）定律。

公式中的K称为吸光系数，它表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。在入射光的波长、溶液种类和温度一定的条件下，K为定值。吸光系数是有色化合物的重要特性之一，在比色分析中有着重要的意义。K值愈大，表示该物质对光的吸收能力愈强，浓度改变时引起吸光度的改变愈显著，因此比色测定时灵敏度愈高。

朗伯-比尔定律即有色溶液对一定强度光的吸收程度，与液层厚度和溶液中有色物质浓度的乘积成正比。其中朗伯定律说明吸收光与厚度间的关系；比尔定律说明吸收光与浓度间的关系。

朗伯—比尔定律在光电比色计中的应用

假定有两种有色溶液，其中一种是已知浓度的标准溶液，另一种是待测溶液。根据公式：
在标准溶液中：As=KsCsLs 1-4
在待测溶液中：Ax=kxCxLx 1-5
将式1-4除以式1-5可得：
= 1-6

如果上述两种溶液的液层厚度相等、温度相同而且是同一种物质的两种不同浓度的溶液，测定时所选用的单色光的波长亦相同，则有：
Ls=Lx、Ks=Kx ，代入式1-6可得：
= 1-7

由此可见，在上述条件下，吸光度与浓度成正比。这一关系式就是光电比色计的设计依据，也是比色分析的基本计算公式之一。式中标准溶液的浓度Cs为已知，As和Ax可用光电比色计测量出来，则待测溶液的浓度Cx即可求出：
Cx = × Cs 1-8

由于在实际测定时，标准溶液和待测溶液都要加以稀释，而且在报告结果时，多以100毫升（或1000毫升）中的含量来表示。因此，在实际计算时，就需要在上式中乘上稀释因数。

求待测溶液浓度的方法有：直接比较法（计算法）、因数法和标准曲线法三种。这些方法在“生物化学及生物化学检验技术”课程中有介绍。

波长的选择：
由于有色溶液对光的吸收具有选择性，因此进行比色测定时，滤光片必须加以选择，否则灵敏度很低，导致测量结果不准确。选择滤光的一般原则是：滤光片最大透过的光线应该是溶液最大吸收的光线。从颜色上看，滤光片的颜色与待测溶液的颜色应为“互补色”。

什么叫做互补色呢？凡是两种颜色相加后能得到白色，则此两种颜色就称为“互补色”，图中直接相对的两种颜色，均为互补色。

为什么选择滤光片时，要使滤光片的颜色与待测溶液的颜色为互补色呢？这是因为滤光片和有色溶液具有相似的透光特性，与它们本身颜色相同的色光，能够最大限度地透过。而与它们本身颜色成互补的色光都能被最大地吸收。