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菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境。
一般菌种临时存放及活化
1. 低温保存管应存放于－20℃~－80℃之低温条件下。
2. 准备37℃之70﹪酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架，液面不可高达管塞。
3. 将低温保存管从低温保存条件中取出，置于37℃浴槽之小试管架上。
4. 不断轻微摇动低温保存管，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需2分钟）。
无菌培养
1.用无菌微量吸管，从已溶解之低温保存管 吸取 1-2滴之菌液，滴入固态指定培养基某一边缘附近，以划线法接种于培养基。
2.将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。
平板划线分离法
平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
1.手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约5cm）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约10公分，等待约10秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖1/3培养基为止。
2.灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自I区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域。
3.重复2的动作完成。
4.灼烧接种环，将接种环归位。
（1）金属接种环
（2）平板划线法
一般操作过程
1.在无菌操作下，用无菌微量吸管，从已溶解的管中吸取50μL（或1-2滴）的菌液，滴入固态指定培养基（培养基编号及温度示于菌株订购单）某一边缘附近，以划线法接种于培养基。
2.将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。
3.在无菌环境下，以沾有75%酒精的棉花擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。
4.（a）适用于细菌用无菌吸管，吸取0.3-0.5mL指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。
（b）适用于霉菌、酵母菌用无菌吸管，吸取0.3-0.5mL无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。
5.取0.1-0.2mL之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。
6.某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期(lagperiod)较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养(Subculture)后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。
