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在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：
(1)要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵(PH 5.16)做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心；
(2)梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来，用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡；
(3)混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多(甲醇-水体积比为1：1时压力最大)，因此要防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力；
(4)每次梯度洗脱程序运行完之后必须对色谱柱进行彻底平衡，使其恢复到初始的状态，需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相和初始流动相达到完全平衡，平衡不好会影响下一针样品的分离度和保留时间：下图所示的平衡时间从从上到下分别为6、7、8、9分钟，可以看出平衡6、7分钟第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8、9分钟所有峰保留时间变化不大，说明色谱系统平衡充足；
(5)注意梯度洗脱用水的有机物残留，往往在等度洗脱时用的水，在梯度洗脱时发生问题(鬼峰)，这是因为在梯度过程中，水占的比例很高时的流动相洗脱能力很低，此时水中的有机物残留就被色谱柱吸附并浓缩，等到强溶剂占高比例时，浓缩的有机物被高洗脱能力的流动相洗脱而流出色谱柱，并成为一个色谱峰，从而干扰分析；
(6)梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器(如紫外吸收检测器或荧光检测器)，而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器(如示差折光检测器)。
文章来源：网络
