1.非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现,其原因:
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有:必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。
2.片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于
(1)酶量过多或酶的质量差
(2)dNTP浓度过高
(3)Mg2+浓度过高
(4)退火温度过低
(5)循环次数过多
其对策有:
(1)减少酶量,或调换另一来源的酶
(2)减少dNTP的浓度
(3)适当降低Mg2+浓度
(4)增加模板量
(5)减少循环次数