8. 线性
样本经梯度稀释后检测分析即为线性分析,此过程也是用于消除样本的基质效应。基质效应导致的结果有假阴性和假阳性两种,在线性稀释时就可以辨别出来,当存在基质效应时样本的稀释线性就不会满足,说明该类样本有可能不适用ELISA kit,在研发阶段就需要优化反应体系等消除基质效应带来的干扰。
9. 回收率
回收实验可检测试剂盒是否受干扰因子的影响,也是辨别基质效应的一种方法。在研发过程中,一般会采用低、中和高浓度的分析物被掺入到已知浓度的验证样本中,进行回收实验测定,回收率应介于80%-120%,表明试剂盒的性能较好。
10. 稳定性
即试剂盒在有效期内的稳定性。通常采用加速降解的方法来推断试剂盒的有效期。通常试剂盒在37℃放置一天折合有效期2个月,实际工作中,一般将试剂盒在37℃破坏3-7天后,然后检测上述指标,观察是否在范围内。也可留样至有效期后进行检验,来衡量有效期,对于批量大的指标,可将加速降解和留样检验相结合的方法。
另外,ELISA实验操作时质控标准如下:
1、严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡30~60min。
2、加样后及时放人孵箱。标本较多时,要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间,防止孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻di。
3、封板温育时,各孔一定要封严,防止阳性标本的液体蒸发,产生周边现象从而导致“花板”的出现。
4、用洗板机洗板时,保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干:还要防止针口有纤维蛋白或异物,这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。
5、合理安排检测量,以免反应板过多造成洗板等待时间长。
6、加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。
7、显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。
8、加样时保持显色剂不外流;A、B液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。
9、应保证C清洁,整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至低限度。从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。