手机版
| 产品索引 | 5872 |
| 中文名称： | PCR产物及凝胶回收试剂盒 |
| 英文名称： | MagExtractor®-PCR & Gel Clean up- |
| 产品编号： | NPK - 600 |
|
产品类别： |
分子生物学 |
| 生产厂家： | TOYOBO |
| 产品价格： | 300元 |
| 产品规格： | 50次 |
DNA Fragment Purification Kit
MagExtractor®
-PCR & Gel Clean up-
使用说明书
(Code No. : NPK – 601)
TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
OSAKAJAPAN
—目录—
[1] 前言 ........................................................................................... 1
[2] 纯化流程...................................................................................... 2
[3] 试剂盒中所包含的物品................................................................. 3
[4] 试剂盒以外所需要的其他物品...................................................... 3
[5] 回收DNA溶液............................................................................. 4
[6] 回收琼脂糖凝胶........................................................................... 5
[7] 疑难解答...................................................................................... 8
注意：
本试剂盒中所包含的都是研究用试剂。请不要用于诊断，临床等场合。在使用本试剂盒的时候，请严格遵守实验室的基本注意事项，注意安全。由于本试剂盒内含有对人体有害的试剂，所以请务必严格遵守各试剂的相关使用说明书，按要求使用保护罩等防护措施。
[1] 前言
MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic（盐）试剂存在的情况下，核酸能吸附在硅胶上的特性1），用于手动对DNA片段进行纯化。本试剂盒采用磁硅胶粒子，若使用磁性台架，则能最大限度地减少复杂的离心操作，能够快速地的纯化DNA片段。
1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
特征
|
·从DNA溶液（约100μl），以及TAE·TBE琼脂糖凝胶（约0.3g）中，
能够以平均回收率60～70％比例回收DNA片段（约100bp～50kbp）。
·能够在5分钟之内从DNA溶液中，或者在15分钟之内从琼脂糖凝胶
中回收DNA片段。
·由于在室温下琼脂糖凝胶可以被融解，因此无需进行加热反应。
* 要彻底去除混杂在回收液中的乙醇时则需要进行加热处理（55℃）。
|
试剂盒的用途
|
·脱盐，去除dNTPs。
·去除引物。
·去除酶（碱性磷酸酶等）。
·从电泳后的琼脂糖凝胶块中回收DNA。
|
回收的DNA的用途
|
·RI.Non-RI测序反应
·限制酶反应
·标记反应
·杂交反应
·连接反应
·转化反应
·扩增反应
|
[2] 纯化流程
下图显示为使用MagExtractor-PCR &
Gel Clean up-时的纯化流程。
纯化DNA片段
Elute
|
75％乙醇
|
|
洗净液
|
|
溶出液
|
|
磁石
磁性或离心分离
|
|
磁珠
|
|
Wash
|
|
Bind
|
|
Melt
|
|
凝胶块
|
|
吸附液
|
|
电泳后的凝胶
|
[3] 试剂盒中所包含的物品
本试剂盒中包含以下试剂。（200次份）
|
|
试剂量
|
保存条件
|
|
吸附液*
|
88ml
|
避光室温保存
|
|
洗净液*
|
132ml
|
室温保存
|
|
磁珠
|
7ml
|
室温保存
|
*吸附液，洗净液在低温情况下会析出结晶。请一边用手捂暖，一边
将其倒转混合让结晶溶解后使用。另外，吸附液及洗净液内含有蛋白
变性剂。在使用时务必注意，万一沾到身体，请立刻用清水冲洗。
[4] 试剂盒以外所需要的其他物品
1．试剂
·灭菌蒸馏水<溶出液>
·75％乙醇<洗净用>
2．器具，器材
·1.5ml小型试管用磁性台架
·简易台式离心机
·漩涡混合器
·Heat Block 55℃（用于在需要去除混于回收液中的乙醇的场合）
*可使用本公司的磁性台架Magical Trapper（Code No.：MGS-101）等产品。
[5] 回收DNA溶液
1．前言
·本操作程序用于从DNA溶液（约100μl）中回收DNA片段。
·能够回收的DNA大小约为100bp～50kb。另外，40bp以下的核酸
几乎能够被加以除去。
· 磁珠的最大吸附量为每30μl磁珠大约吸附5μg。使用时请以2.5μg左右为参考量。
·能够从PCR反应液，限制酶反应溶液，碱性磷酸酶反应液等各种反
应液中回收DNA。
·回收后的DNA，能够用于限制酶处理、测序、连接、标记、杂交等多种反应
1．前言
·本操作程序用于从DNA溶液（约100μl）中回收DNA片段。
·能够回收的DNA大小约为100bp～50kb。另外，40bp以下的核酸
几乎能够被加以除去。
· 磁珠的最大吸附量为每30μl磁珠大约吸附5μg。使用时请以2.5μg左右为参考量。
·能够从PCR反应液，限制酶反应溶液，碱性磷酸酶反应液等各种反
应液中回收DNA。
·回收后的DNA，能够用于限制酶处理、测序、连接、标记、杂交等多种反应
2．操作程序
DNA溶液（100μl）1）
↓← 400μl吸附液
↓← 30μl磁珠2)
↓不时用漩涡混合器搅拌，并放置约1～2min（室温）
B/F（固/液）分离3）
↓←（600μl洗净液）4）
↓漩涡混合器搅拌10sec，
B/F分离。3）
↓←1ml75％乙醇4）
↓漩涡混合器搅拌10sec，
B/F分离。3）
瞬时高速离心，彻底去除上清部分。
（打开小型试管的盖子，55℃下放置5min，干燥）4）
↓←25～100μl蒸馏水
↓漩涡混合器搅拌10sec，
（在无法充分将粒子分离的情况下，请用pipetting来分离粒子。）
↓放置2min
B/F分离，回收上清液。5）
1）请尽量不要含矿物油。
2）使用磁珠前，请彻底悬浊混合后再使用。
3）将试管放置在磁性台架上，把磁珠挪近磁石，用微量移液器持续去除
上清部分。通过乙醇清洗时，可以通过将上清液倒入其他容器进行去除。
B/F分离时推荐使用对应于微型试管的磁性台架，但也可用简易台式离心机，用大约6,000r.p.m程度，5sec.的离心进行分离。g会根据离心机的转子口径而发生变化，所以请调整旋转数，使得能更有效地集合粒子，并保证凝结不至于过度。
4）请参照3.的表。
5）回收液中少量混入的磁珠并不会有碍下一次的反应，但在测定吸附度
等场合时，请通过瞬时高速离心除去磁珠。
3．关于工序的省略，纯化规模
·洗净工序，加热工序可以省略（请参照下表）
|
用途
|
洗净
|
干燥
|
备注
|
|
|
洗净液
|
75％乙醇溶液
|
|||
|
测序，限制酶反应，连接反应等的前处理
|
－
|
1次
|
－
|
标准操作程序。回收的核酸能用于Low Buffer系列的限制酶切断。
|
|
盐的混入会产生影响的场合
|
－
|
2次
|
－
|
吸附液和洗净液含有高浓度的盐分。
|
|
乙醇的混入会产生影响的场合
|
－
|
1次（2次）
|
55℃，5min
|
用于易受乙醇影响的前处理。
|
|
要去除混入的酶的场合
|
1次
|
1次（2次）
|
－
|
用于去除碱性磷酸酶等。
|
|
要通过吸光度来准确定量核酸浓度的场合
|
1次
|
2次
|
－
|
吸附液内含有能吸收紫外线的物质。
|
·根据DNA溶液的量，可以按比例减少本试剂盒中附带的吸附液、洗净
液和磁珠的使用量。此时，无需减少75％乙醇溶液的使用量。
[6] 回收琼脂糖凝胶
1．前言
·本操作程序适用于从TAE或者TBE琼脂糖凝胶（约0.3g）中回收
DNA片段。本操作程序是以琼脂糖浓度2％以下的凝胶为对象。
要使用2％以上的凝胶时，推荐所使用凝胶的量少于0.3g。另外，本
操作程序不需要使用特殊的低融点琼脂糖凝胶。
·能够回收的DNA大小约为100bp～50kbp。
·回收后的DNA主要用于连接反应、标记、测序等反应。
2．操作程序
琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色。
↓
在UV照射下（Long wave），为了使得目标条带尽可能地变小，使
用切割刀或手术刀等进行切开。
↓
把切开的琼脂糖切细，放到1.5ml小型试管中。（此时称得重量，如
果大于0.3g则分几次进行。）1）
↓←400μl吸附液
在凝胶完全溶解之前，将其放置在室温中，并不时进行搅拌。2）
↓←30μl磁珠3）
↓经常用漩涡混合器搅拌，并放置2min（室温），
B/F分离。4）
↓←600μl洗净液
↓漩涡混合器搅拌10sec，
B/F分离。4）
↓←1ml75％乙醇溶液5）
↓漩涡混合器搅拌10sec，
B/F分离。4）
瞬时高速离心，彻底去除上清部分。
（打开微型试管的盖子，55℃下放置5min，干燥）5）
↓←25～100μl蒸馏水
↓漩涡混合器搅拌10sec
（在无法充分分开粒子的情况下，请用pipetting来分散粒子。）
↓放置2min
B/F分离，回收上清液6）
1） 将琼脂糖凝胶制成切片，以利于溶解。
2） 如果想要快速溶解琼脂糖凝胶或凝胶难以溶解时，请加温至55℃
5min。
3） 使用磁珠前，请彻底混合后再使用。
4） 将试管放置在磁性台架上，把磁珠挪近磁石，用微量移液器持续去
除上清部分。要洗净乙醇，也可以通过将上清液倒入其他容器来去除。
B/F分离时推荐使用对应于微型试管的磁性台架，但也可使用简易台式离心机，用大约6,000r.p.m程度，5sec.的离心进行分离。g会根据离心机的转子口径而发生变化，故请调整旋转数，使得更有效地集合粒子，并保证凝结不至于过度。
5） 请参照3.的表。
6） 回收液中混入少量磁珠并不会有碍下一次的反应，但在测定吸附
度等场合时，请通过瞬时高速离心除去磁珠。
3．关于工序的省略，纯化规模
·洗净工序，加热工序可以省略（请参照下表）
|
用途
|
洗净
|
干燥
|
备注
|
|
|
洗净液*
|
75％乙醇溶液
|
|||
|
连接反应, 测序等
|
1次
|
1次
|
－
|
标准操作程序。
|
|
盐的混入会产生影响的场合
|
1次
|
2次
|
－
|
吸附液和洗净液中含有高浓度的盐分。
|
|
乙醇的混入会产生影响的场合
|
1次
|
1次（2次）
|
55℃，5min
|
用于容易受乙醇影响的前处理。
|
|
要通过吸光度来准确定量核酸浓度的场合
|
1次
|
2次
|
－
|
吸附液内含有吸收紫外线的物质。
|
*从琼脂糖凝胶中回收核酸时，必须用洗净液清洗。
·根据DNA溶液的量，可以按比例减少本试剂盒中附带的吸附液、洗净
液和磁珠的使用量。此时，无需减少75％乙醇溶液的使用量。
[7] 疑难解答
1．回收量低
|
原因
|
对策
|
|
去除乙醇不彻底
|
瞬时高速离心后，请仔细去除75％乙醇溶液。
|
|
溶出不充分
|
通过10mM Tris-HCI（pH8.0），或者TE buffer能够提高溶出的效率。另外，如果加温至55℃保持2min能够更加有效地提高溶出效率。
|
|
吸附时间不合适
|
如果吸附过剩，回收量则会变少。最恰当的吸附时间是，对于DNA溶液为1～2min，对于凝胶则为2min。
|
|
溶出时的搅拌不充分
|
溶出时，如果磁珠的混合不充分，回收量会减少。在瞬时高速离心后，磁珠会在底部结块，请仔细将其散开。特别是在从琼脂糖凝胶中进行纯化的时候，结块的磁珠会比较难以重新散开。
|
|
琼脂糖凝胶的量大于0.3g
|
请减少琼脂糖凝胶的量。
|
|
使用2％以上的琼脂糖
|
请减少琼脂糖凝胶的量。
|
|
没有用洗净液清洗
|
从琼脂糖凝胶中回收DNA时，请务必先用洗净液清洗。
|
2．回收的核酸的吸光度不准确
|
原因
|
对策
|
|
清洗不充分
|
吸附液中含有吸收紫外线的物质。要对回收的核酸定量，请用洗净液以及75％乙醇溶液来清洗。
|
|
混入了吸附液
|
吸附液中含有吸收紫外线的物质。请仔细去除吸附液。用面纸等擦拭试管的盖子上沾有的吸附液，可以有效改善状况。
|
3．回收后的核酸不能良好地进行反应
|
原因
|
对策
|
|
盐阻碍了反应
|
请添加两次75％乙醇溶液进行清洗的工序。吸附液和洗净液都含有高浓度的盐分。
|
|
乙醇阻碍了反应
|
请按照操作程序，对乙醇进行干燥处理。
|
|
酶未能完全去除
|
要去除反应液中的碱性磷酸酶等酶，请用洗净液以及75％乙醇溶液进行清洗。
|
|
反应用的酵素过少
|
从琼脂糖凝胶中回收核酸时，反应用的酶量应比通常要多，这样就能得到准确良好的结果。
|
|
使用的琼脂糖级别不够
|
请使用高级别的琼脂糖。
|
|
从琼脂糖凝胶中分离条带时，受到的紫外线照射过多
|
请用Long wave（365nm附近）的紫外线来进行切片工作。
|
