六、奶牛胚胎移植产业化的相关技术

    胚胎生物技术是生物技术的重要内容之一，所包括的具体技术内容和研究的热点很多，有些技术已比较成熟，开始或即将用于胚胎移植产业化的实践，但尚有很多技术内容仍处于实验室阶段，离实际应用还有相当的距离。
  （一） 、胚胎的冷冻保存
    胚胎冷冻保存的成功使奶牛的胚胎移植不再受时间和空间的限制，完全可以根据受体母牛的发情情况人为确定胚胎移植的时间。其次，使胚胎的国际、国内交换以及长期保存成为可能，大大推动了胚胎移植产业化的进程。
    目前常用的胚胎冷冻方法主要有两种：
    1、慢性冷冻保存
    此法是将胚胎置于抗冻保护剂溶液中，经缓慢降温，一般降温速度为1每分钟摄氏度到3每分钟摄氏度，达到一定的温度后投入液氮（-196摄氏度），即可长期保存。经冷冻保存的胚胎在移植前经解冻进行移植。这种方法由于降温速度慢，可在胚胎完全冻结前脱出细胞内的水分，防止冰晶形成对胚胎的伤害。整个冷冻过程需要2-4小时，比较费时。目前已有各种类型的胚胎冷冻仪，可以进行电脑程序控制，保证了每一批的冷冻质量。该法已在国内外广泛应用，成为一种常规的胚胎冷冻保存方法。
    2、玻璃化冷冻保存
    此法是将胚胎置于特制的高浓度的冷冻保护液中，只需要几分钟的平衡时间即投入液氮中完成冷冻保存过程。胚胎解冻后的生存能力不低于慢速冷冻保存。此法不需冷冻仪和特殊设备，在没有实验室的现场条件下即可操作。由于整个冷冻过程只需几分种的时间，缩短了操作的时间，具有很好的推广和应用前景。
  （二） 、体外受精
    奶牛的体外受精是指精子和卵子在体外人为控制的实验室条件下完成受精的技术，也是奶牛胚胎生产的方式之一，以这种方式得到的胚胎叫体外胚胎。
    目前，进行体外受精的卵子（卵母细胞）有两种获取方法：
    1、宰场刚屠宰的母牛体内摘取卵巢，以一定的方法处理后，从卵巢上收集卵母细胞，要求卵泡直径为3-10亳米。然后将这些卵母细胞在二氧化碳培养箱内培养成熟，再与经获能处理的公牛精子放在一起完成受精，继而把受精卵培养至囊胚阶段进行移植或冷冻保存。从废弃的卵巢中采集卵母细胞生产胚胎的方式，材料来源丰富，生产成本低，便于工厂化操作，可做到成批生产的目的。存在问题是母牛的来源及系谱无法确定；其次，这类胚胎移植的受胎率低，应用时应慎重考虑。
    2、从活体母牛卵巢直接收集卵母细胞
    这种方法要借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜等直接由活体母牛的卵巢上吸取可用的卵母细胞。随后的体外培养和受精过程与屠宰场获取的卵巢卵母细胞相同。
    值得注意的是不管采用哪种方法生产的体外胚胎普遍存在活力较低，移植后产犊率低，胎儿初生重高，容易造成母牛难产等实际问题。
  （三） 、胚胎切割
    胚胎切割是指运用显微镜操作仪或其他简单设备将附植前的囊胚期胚胎分割为若干具有继续发育潜能部分的技术，是提高胚胎利用率的有效方法之一。
    在进行胚胎切割时为了便于操作和切割后的胚胎发育，一般选用发育到桑椹胚或囊胚最为适宜。一般借助微针或微刀对准胚胎内细胞团的部分进行均等的直接下切，以保证切割后的部分有均等的发育能力。从理论上讲胚胎的切割可能是无限的，但是实践证明只有二分胚的发育能力最强。近几年通过实验证明，二分胚直接移植的受胚率也可达40%以上，这无异是提高了胚胎利用率，但对这一技术仍需加强研究，简化操作，提高效率。
    五、胚胎的性别控制
    奶牛的性别控制是指采用某些人为的技术方法控制受精后胚胎性别，这是从根本上控制后代的性别比例，又称性比控制。目前，人们将奶牛早期胚胎在移植前进行性别鉴定，以达到按生产需要获得单一性别犊牛的需要的方法也纳入奶牛性别控制内容。
    奶牛只有母牛产奶，一般情况下，非超群公、母牛所生的公犊生产价值极低。无论采用何种技术方法使奶牛多产母牛、少产公牛一直是人们长期努力的目标。一些方法虽然几经努力，但收效甚微。下面仅介绍两种奶牛性别控制的方法，不久将对奶牛的性别控制发挥明显作用。
     (一）、X和Y精子的分离
目前，X和Y精子的分离的准确而有效的方法是流式细胞器分离。其理论根据是X精子是DNA的含量比Y精子高3-4%。具体的方法是：用特异的染料对精子进行染色，随后将精子连同少量稀释液逐一通过流式细胞器的激光束，其探测器可感知精子染色后的发光强度并将这一信息传递给计算机，经分辨后计算机令液晶充电器使发光较强的精子分离，进入两个不同的收集容器。这样，正电荷收集器容器得到的是X精子，负电荷收集器容器则为Y精子。用分离后的精子进行人工受精、体外受精或是显微受精就可以得到单一性别率高的胚胎或犊牛。国外此法已开始用于商业化的运作，分离的准确率达90%以上。每小时可得到一个输精剂量的分离精子。存在的主要问题是：流式细胞器的造价很高，投入大；分离的速度虽有较大提高，但也有下降趋势。随着这一技术的不断改进和提高，这一性别控制技术将给奶牛业带来巨大效益和广阔的应用前景。
  （二）、SRY片段PCR扩增胚胎性别鉴定法
    最近10年来发展的用公牛特异性DNA探针和PCR（聚合酶链式反应）扩增技术对奶牛早期胚胎进行性别鉴定的一种准确有效的方法。其主要操作步骤是：从被测胚胎取部分卵裂球用以提取DNA，再用SRY基因的片段作引物，以所取的胚胎细胞DNA为模板进行PCR扩增，最后用SRY特异探针对扩增的产物进行检测。雄性胚胎显示呈阳性，雌性胚胎为阴性。也可对扩增产物进行电泳，根据SRY条带的有无判断胚胎为雄、雌。随着这项技术的深入研究和进展，目前只需几个卵裂球即可完成检测的取样，减少了对胚胎的伤害。经鉴定的胚胎，移植后产犊性别的准确率可达95%以上。
    此法整个操作只需几十分钟，有较好的应用前景，已开始了商业运作。存在的主要问题是需要实验室条件和检测人员的技术水平较高，否则会有假阳性结果出现，影响准确率；其次，检测试剂盒成本较高，无疑会增加被检测胚胎的成本。

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