现代鱼病的诊断技术

　　随着我国鱼类养殖规模的不断扩大和集约化水平的提高，各种鱼类病害的发生日益频繁，危害也越来越严重，已成为制约整个水产养殖业发展的最重要的因素之一。目前，在中国广为流行的水产动物疾病（病害）就达100种以上，每年因疾病所造成的产量损失达20%以上，经济损失可达百亿元。日益严峻的现实使我们认识到，控制水产动物疾病已迫在眉睫，寻求水产动物病害的有效防治方法越来越受到国内外学者的广泛关注，其中水产养殖动物病原的快速、准确检测是对水产动物病害进行有效防治的基础和先决条件。因此，建立水产养殖动物病原的快速、准确检测方法和水产动物疾病的快速诊断技术不仅能直接用于水产动物病害的有效防治，还将为水产养殖业的可持续健康发展奠定良好基础。

　　由于传统的病原检测方法存在灵敏度低、特异性差、费时费工等缺点，已不适应当前水产养殖业及时控制病害的要求。因此，利用现代检测方法和技术研究开发灵敏度高、特异性强的鱼类疾病快速检测方法十分必要。近年来，随着免疫学技术和分子生物学技术的发展，鱼类病害的检测技术已经有了长足的进步。在今后的工作中，研究特异性强、敏感性高、方便、快速的鱼病诊断技术，是水产科研工作者一致的目标。

　　1、免疫学技术

　　免疫学技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应，检测病原微生物，该方法已经成为实验室常用的检测技术。目前，用于鱼类疾病诊断的免疫学技术主要有单克隆抗体技术、凝集反应技术、荧光抗体技术、酶免疫技术、胶体金技术等。

　　单克隆抗体技术是利用单抗的特异性、均一性、高效性来进行疾病的诊断，该技术具有快速、简单、灵敏度高的特点，但单克隆抗体的制备方法还有待改进。2013年，贾鹏等制备了抗传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)单克隆抗体6G7，该抗体效价高、灵敏度高，特异性强，与天然抗原亲和力强忙，可用于传染性造血器官坏死病毒的快速诊断。

　　凝集反应技术主要用于病原微生物的分型和鉴定，具有特异，快速，设备简单，适用于基层的特点。

　　荧光抗体技术是在免疫学、生物化学和显微镜的基础上建立起来的一项技术，该技术的优点是特异性强，敏感度高，但对仪器设备要求过高。鄢庆枇等在2006年应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的弧菌。

　　酶免疫技术的方法很多，用于水产动物疾病诊断的主要是酶联免疫吸附试验(ELISA)技术和斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)技术。该方法具有操作简便，灵敏度高，仪器简单，可定量的优点。战文斌等在2014年发明了一种双抗体夹心ELISA检测对虾白斑症病毒的检测方法；吴志新等在2009年发明了柱状黄杆菌的Dot-ELISA检测方法。

　　胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。运用较多的是胶体金免疫层析技术(GICA)和快速斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)。孟小林等在2007用免疫胶体金结合免疫层析法研制了一种快速检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)的试剂条，并申请了专利。

　　2、分子生物学技术

　　分子生物学技术是以病原核酸为研究对象，通过对病原的核酸进行鉴定来证实病原。近年来，利用分子生物学技术对各种病原进行检测发展非常迅速。用于鱼类疾病诊断的分子生物学技术有核酸杂交技术、PCR（聚合酶链式反应）技术、LAMP（环介导等温扩增）技术、限制性酶酶切检测技术、16S rRNA检测技术和基因芯片技术。

　　核酸杂交技术是利用特异性标记的DNA或RNA作为指示探针，使其与病原核酸中互补的靶核苷酸序列进行杂交，从而确定宿主是否携带某种病原体。该方法已经在多种水产动物病原体的检测中应用。雷质文等在2001年用PCR法制备了DIG标记的探针，建立了斑点杂交检测WSSV的方法；外国科研工作者在1991年研制了生物素标记的反意义探针检测IHNV，该探针只能和IHNV反应并且可以识别所有的IHNV毒株。

　　PCR技术是通过酶促反应合成特异性DNA片段的方法，其用于疾病诊断是基于扩增病原的特异性DNA片段。近年来，PCR技术已经成为实验室进行鱼病诊断的常规技术，用于疾病诊断及其衍生来的PCR技术有常规PCR、套式PCR、多重PCR、免疫PCR、实时荧光定量PCR。张辉等在2012年建立了草鱼出血病病毒的RT-PCR检测方法；徐进等在2013年建立了鲤疱疹病毒2型的套式PCR检测方法；张德锋等在2014年建立了同时能检测嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和鮰爱德华氏菌的多重PCR检测方法，可用于水生动物败血症的快速诊断；刘箐等在2014年建立了副溶血弧菌的免疫PCR检测方法，其灵敏度可达到103~104cfu/mL；刘春等在2014年建立了杂交鳢弹状病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，最低可以检测到10个病毒核酸分子拷贝。

　　LAMP技术是一种新的核酸扩增技术，其反应速度快、操作简单，产物检测方便，已被用来进行鱼类疾病的诊断。张金凤等在2013年建立了逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP) 检测草鱼出血病病毒的方法，最低检测限为33pg，比PCR方法灵敏度高10倍。广州迪澳生物科技有限公司的李红梅等在2013年建立白斑综合症病毒的LAMP检测方法及其检测试剂盒，并申请了专利，该试剂盒操作简单，适合现场检测，特异性强，灵敏度高，可达1fg/μL。

　　限制性酶可识别DNA上较短的序列，在识别位点上切开DNA，单个核苷酸变化即可导致限制性酶切位点的增加或缺失。因此，酶切后产生的片段数目发生了改变，即所谓的限制性片段长度多态性(RFLP)。根据酶切后的DNA片段在凝胶电泳上进行分离，染色后即可观察各个不同大小的片段，进行遗传变异的分析。

　　16S rRNA检测技术是基于生物体的16S rRNA的保守性和差异性建立的一种鉴定病原菌的标准方法，主要用于病原细菌的鉴定、分类。

　　基因芯片技术是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。基因芯片技术用于鱼类疾病的检测，国内外都还处于起步阶段，仅用于诊断一些主要的细菌病和病毒病。