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草甘膦内吸性很强，几乎对所有绿色植物都有效果（对褐色棉秆杀伤小）。但在杂草刚出土、还未长出足够接受药剂的叶片时用药，或者在杂草草龄过大时用药防效较差。在杂草生长成株且茂盛时用药，效果最佳。一般在6月中下旬后用药，施药过早，棉苗小，抗药性差，易发生药害。
防除一年生杂草，每亩用10%草甘膦水剂500毫升；防除多年生杂草，每亩用草甘膦1000-1500毫升。重点对杂草基部茎叶喷药。对多年生杂草，用药后1周再挑治1次。马齿苋、凹头苋等对草甘膦抗性较强，用药后1周再用药1次。
草甘膦不能防除没有出土的杂草，使用该药剂定向化除时可以每亩加50%乙草胺乳油100毫升，防止杂草萌生。但不可以与克芜踪等速杀型除草剂混合使用，以免杂草地上部分过早死亡，丧失对草甘膦的内吸传导能力，降低其对杂草地下根茎的杀灭效果。另外，在草甘膦药液中加入0.1%的洗衣粉，或者每亩药量加30克柴油，能增强药剂的展布性，提高防效。
棉田定向化除应选择无风的晴好天气，并加防护罩，确保施药后1-2天无雨（如施药后遇雨，棉株生长点会发生轻微药害）。对少量误施草甘膦的棉叶，应立即摘除；施药后杂草还没有完全死亡之前，不要锄草、拔草。
