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国内外对食品防腐剂的合成、筛选、抗菌性能和抗菌机理进行了大量的实验研究。在食品中添加高浓度食盐、食糖、醋(乙酸)、乙醇或化学防腐剂是人们保存食品的传统方法。但这些小分子食品成分可降低水分活度,使菌体蛋白变性,并影响和改变细胞形态和细胞结构,其机理主要是使菌体脱水。由于添加量大,所以通常会掩盖或破坏食品自然风味。为寻找保持食品固有色、香、味的天然防腐剂进行了长期的研究。主要集中在研究开发广谱、高效、低毒、天然的食品防腐剂。
1 天然防腐剂的主要来源
1.1 植物性天然防腐剂
Knobloch(1998)等对植物芳香精油的抗菌能进行了研究,其抗菌性能则基于抗菌剂在菌体细胞膜双磷脂层中的溶解度;而精油中的类萜类降低
生物膜的稳定性并干扰能量代谢的酶促反应。佐藤昭子(1990)、马慕英(1993)、席屿芳等(1993)研究出大蒜、洋葱、生姜汁液中辛辣组份可抗青、绿霉菌。Kyung和Fl℃rning(1994)发现不含辛辣成分的白菜汁液在酸性条件下对乳酸菌有一定抑制作用。Hoffmann等(1992)曾报道植物糖苷也有抗真菌活性。日本Muroi和Kubo等人发现苹果中最有效的抗菌活性物质是己稀醛,绿茶中是nero2ledol,腰果中是漆树酸。
1.2 动物性天然防腐剂
近年来,人们发现经细菌、疫苗、某些化学物质及超声波诱导处理后,昆虫体液内产生一些杀菌的物质,其中有一类由数十个氨基酸残基组成,称为抗菌多肽。姜明等也从柞蚕中诱导出抗菌肽,在pH3~6,浓度2%以上时,杀菌速度大于大肠杆菌增殖速度,其作用机理是杀菌。在食品领域研究最多的则是昆虫抗菌多肽(Cecropin)。
1.3 微生物防腐剂
用发酵法生产溶菌酶作为食品防腐剂是成功先例Nakamura等人采用酶修饰法先后合成了溶菌酶)环糊精和溶菌酶)半乳甘露聚糖,这些糖蛋白抗菌活性比溶菌酶更高,还具有良好的乳化性能。Ibrahim等合成了脂酰基溶菌酶,其抗菌性依脂肪酸烷链增长而提高。Norman(1994)发现乳酸链球菌肽(nisin),枯草杆菌素(subtilin)等微生物抗菌肽中含有的稀有氨基酸及环肽结构是抗菌活性的原因所在。
2 天然肽类防腐剂的研究
在天然防腐剂中,有一大类属肽类防腐剂,由于其安全无毒害,且对人体有一定营养保健作用而受到人们广泛关注,成为防腐剂的研究热点。
2.1 溶菌酶
溶菌酶Lysozyme是一种专门作用于细胞壁的水解酶,存在于人的唾液、眼泪、蛋清、哺乳动物乳汁、植物和微生物中。它对人体安全无毒,无副作用,且具多种营养与药理作用,所以是一种安全天然防腐剂。溶菌酶是一种比较稳定的碱性蛋白质,在酸性下最稳定。在pH3时能耐100℃加热40min,在中性和碱性条件下耐热性较差,pH7时100℃处理10min就失活。研究最多的鸡蛋清溶菌酶由129个氨基酸残基组成,具有4个二硫键,分子相对质量为14000,最适pH为6~7,最适温度为50℃。
前发现的微生物溶菌酶大体有以下5种。
(1)内N)乙酰己糖胺酶,此酶可破坏细菌细胞壁肽聚糖中的B)1,4糖苷键。
(2)酰胺酶,能切断细菌细胞壁肽聚糖中NAM与肽/尾0之间的N)乙酰胞
壁酶)L)丙氨酸键。
(3)内肽酶,使肽/尾0及肽/桥0内的肽键断裂。
(4)B)1,3、B)1,6葡聚糖和甘露聚糖酶,此酶分解酵母细胞的细胞壁。
(5)壳多糖酶,分解霉菌细胞壁。因为革兰氏阳性菌细胞壁几乎全部由聚多糖组成,因此主要对革兰氏阳性菌起作用。
2.2 昆虫抗菌肽
抗菌肽的一个典型特征是在一个长的疏水片段后面连有一个强碱性的N)端区域。昆虫抗菌肽(Cecropin)由37个氨基酸残基组成,N端呈碱性,
带正电荷,亲水;C端酰胺化,中性或微酸性,不带电荷或少量负电荷,疏水。5~12位和25~37位构成2个螺旋区域。抗菌肽的抗菌机理是在微生物细胞膜上形成通道,引起细胞质溢流。关于通道形成的具体过程有
不同的几种假说,Chistensen等认为通道的形成可分为3个步聚:
(1)抗菌肽分子通过静电作用被吸附到膜表面;
(2)抗菌肽分子中的疏水尾巴插入细胞膜;
(3)抗菌肽分子的两性分子A螺旋插入膜中,多个抗菌肽分子共同作用形成离子通道。而Fik等认为抗菌肽作用于细胞膜时,N端的两亲螺旋结合在膜表面,只有C端的疏水螺旋插入膜中,进而形成离子通道。Clagu℃等认为抗菌肽通过作用于膜蛋白,引起蛋白质由凝聚失活,细胞膜变性而形成离子通道。
2.3 鱼精蛋白
鱼精蛋白是一种在鱼类精核中发现的聚阳离子肽,有广谱抑菌活性,能抑制枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌等的生长,分子富含蛋白质和精氨酸。
从分子组成上看,鱼精蛋白不具有两亲性,因为分子中的32个氨基酸中21个为精氨酸,由于其多为阳离子、非两亲性质,而无法插入细胞膜内而形成膜通道。鱼精蛋白的作用机制是抑制线粒体电子传递系统中的一些特定成分,抑制一些细胞膜有关的新陈代谢过程。
鱼精蛋白适用于较大pH范围内使用,在中性和偏碱性条件下防腐效果更好。目前应用最广的防腐剂多为酸型防腐剂,只在酸性条件下有效,而在中性乃至偏碱性的食品中使用,效果明显下降。鱼精蛋白的开发使用就可拓宽防腐剂使用的pH范围,而且不需调整对象食品的pH。鱼精蛋白的热稳定性,使它可以与食品热处理并用。而它的抗菌活性可受食品中无机盐的影响,而略有下降,尤其是二价金属离子影响较大,主要营养成分蛋白质、脂肪、糖类对鱼精蛋白的抗菌活性影响较小,这使它在富含糖类和蛋白质类的食品中应用成为可能。但根据国外报道,从鱼精蛋白的进化特点考虑,在含核酸较多的食品或含酸性多糖类较丰富的食品中其抗菌效果相对较低。
2.4 乳酸链球菌素
乳酸链球菌素(Nisin)是乳酸链球菌在变性乳介质中发酵生成的一种小分子多肽抗菌物质,由34个氨基酸残基组成,分子量为3510道尔顿,活
性分子常是二聚体或是四聚体。Nisin中含有5个不同于其它蛋白质的二硫键(硫氨酸和甲硫氨酸),另外还含有脱氢丙氨酸(DHA),甲基脱氢丙氨酸(DHB)等不饱和氨基酸。
Nisin的溶解度和稳定性与溶液的pH值有关,pH值越低,稳定性越高,溶解度也提高。如:pH2.5时溶解度为12%;pH5.0时下降到4%;在中性和碱性条件下几乎不溶解,应用时要先用0102N酸溶解,加入食品中。pH2.0时或更低的稀盐酸中可以经115.6℃灭菌而不失活,但在pH5.0灭菌时失活40%,pH61.时将丧失90%的活力。这种热稳定性与其分子中的5个桥密切相关。Nisin加入食品后,稳定性大大提高,食品中的大分子小分子物质对Nisin有防护作用。因此,用Nisin来防腐的食品必须具有稳定的酸性。而Nisin与热处理杀菌作用是互相促进的,加入少量的Ni2sin(0124~10ppm)可以大大提高腐败微生物的热敏感性。同样,热处理也提高了细菌对Nisin的热敏感性,可以降低热处理强度,保证良好品质。另外,辐射处理和Nisin相结合;山梨酸与Nisin配合使用等可以弥补抗菌谱的缺点,而发挥广泛的防腐作用。
人们已经发现Nisin的6种类型,分别为A,B,C,D,℃和Z。其中NisinA,NisinZ两种类型的研究最活跃。二者性质基本相同,仅在结上
有一个氨基酸差异,Nisin第27位氨基酸残基是组氨酸(His),NisinZ则是天冬酰胺(Asn)。从分子水平上探寻Nisin的抑菌机理一直是研
究的热点。Nisin作用的位点主要是细胞膜。Palm2eri等对Nisin存在下双层脂膜电流和电势测量后,证实了Nisin形成膜通道的能力。细胞质内小分子和离子通过管道流失,更严重则导致细胞溶解而达到杀菌防腐目的。
Nisin不能抑制革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌,专抑制革兰氏阳性菌,特别是细菌芽孢。Nisin对孢子的作用有两点值得注意:
(1)大多数情况下,对细菌孢子的作用方式是抑制孢子萌发而不是杀死
孢子。它对于热加工食品防腐的重要意义在于必须在整个货架期中保持足够的乳酸链球菌肽残留量,以提供对任何存在孢子的连续作用;(2)另一个重要发现是孢子越受到热损伤,就变得对乳酸链球菌肽越敏感。如经121℃热处理3min后存活下来的孢子比未经加热损伤的孢子对Nisin敏感10倍以上。这也是Nisin特别适用于热加工食品防腐保鲜
的重要原因。
GB2760-86规定,罐装食品,植物蛋白食品最大使用量为0.2gPkg;乳制品、肉制品最大使用量为0.5gPkg;一般参考量为0.1~0.2gPkg。
3 天然肽类防腐剂研究趋势
3.1 应用基因工程方法生产
天然肽类防腐剂多为动物体正常蛋白质,故安全性很高,而且像溶菌酶,鱼精蛋白等对人体还有一定保健作用,所以是一类值得大力开发的食品防腐剂。但蛋清、鱼类精巢等原料的供应量很有限,因而妨碍了这些防腐剂的广泛使用。目前人们正尝试通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因,但这可能造成缩主微生物自杀而不能获得表达产物,以融合蛋白质的形式表达抗菌肽基因,虽然可克服这一缺点,但仍有表达产物少的问题。
3.2 肽的分子改造
天然防腐剂与目前广泛使用的化学防腐剂相比,抗菌谱窄,抗菌效果差。所以,人们试图通过分子修饰来提高抗菌性能。例如对昆虫抗菌构效关系的研究表明,螺旋与抗菌肽的活性密切相关,改变两性分子螺旋的螺旋度会影响抗菌肽的活性。如用螺旋度倾向高的氨基酸残基代替螺旋倾向低的残基,抗菌肽的活性将明显提高,相反,降低抗菌肽两性分子A螺旋度将导致抗菌活性的急剧下降,可见两性分子螺旋在维持抗菌肽活性中起着重要作用。溶菌酶被咖啡酸共价修饰后,修饰产物可强烈抑制大肠杆菌等格兰氏阴性菌的生长,大大加宽了溶菌酶的抗菌谱。溶菌酶被环糊精和半乳甘露聚糖修饰后,不仅抗菌活性稳定,而且具有良好的乳化性能,加工性能大为增强。所以,抗菌肽类分子的改造和设计已成为获得新抗菌肽的主要途径。
3.3 与其他防腐剂联合使用
天然肽类防腐剂常和其他添加剂配合使用增强其抗菌效果。例如螯合剂eDTA,eDTA可从革兰氏阴性菌中部分除去含脂多糖的外层膜,因而降低了其对其他防腐剂的抗性。例如,溶菌酶、Nisin等一般只能作用于革兰氏阳性菌,但与eDTA配合使用时他们对革兰氏阴性菌的抑制能力也大为增强。
4 结束语
随着生活水平的不断提高和对健康的日益关注,人们对防腐剂之类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求,因此,人们开始把目光投向于天然防腐剂。它已成为食品领域一个重要研究课题,由于肽类防腐剂所具有的安全无毒害,甚至对人体有一定营养保健作用等优点,其研究开发无疑是一个很有前途的重要课题,肽类防腐剂具有广阔的发展前景。
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