动物的肝脏和脂肪组织是合成甘油三酯最活跃的部位；小肠粘膜在脂肪消化吸收后也可由甘油一酯合成大量甘油三酯。油料作物的胚乳及子叶部分的甘油三酯合成也很旺盛。甘油三酯合成的主要前体是脂酰辅酶A和L-α-磷酸甘油。后者可由糖酵解的中间代谢物磷酸二羟丙酮在磷酸甘油脱氢酶的作用下生成，也可由甘油与ATP在甘油激酶作用下生成。甘油三酯合成的第一步是α-磷酸甘油的两个游离羟基在转脂酰基酶的作用下由两分子脂酰辅酶A酰化生成L-α-磷脂酸。磷脂酸在磷脂酸磷酸酶的作用下生成甘油二酯。甘油二酯与第三个脂酰辅酶A在转脂酰基酶的作用下转变成甘油三酯。