大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种作用：①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。它在切口平移（nick translation）中应用。

　　大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段，要用被切成平头末端的DNA片段连接时，可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。

　　另外还有大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ。前者不能利用单链DNA或poly(dA-dT)为模板。需有镁离子和dNTP时才能表现出酶活性，无自发合成DNA的作用。后者没有5’→3外切酶活性，也不能用单链DNA作为模板。